Procedimiento de replegamiento de proteína NSPA de Neisseria.

Un procedimiento de replegamiento de una proteína NspA que comprende poner en contacto la proteína NspA con un tampón de replegamiento alcalino que comprende 3-dimetildodecilamoniopropanosulfonato (SB-12).

Procedimiento de replegamiento de proteína NSPA de Neisseria Campo de la invención

La presente invención se refiere a un procedimiento de replegamiento de la proteína NspA (una proteína de la membrana externa de los organismos Neisseria meningitidis), y la divulgación se refiere a dichas proteínas replegadas, a composiciones farmacéuticas que las comprenden, y a su uso en el tratamiento, prevención y diagnóstico de infecciones bacterianas, tales como infecciones por Neisseria y, particularmente, pero no exclusivamente, Neisseria

meningitidis y/o Neisseria gonorrhoeae.

Antecedentes de la invención

Las cepas de bacterias Neisseria son los agentes causantes de una serie de patologías humanas, contra las cuales hay una necesidad de desarrollo de vacunas eficaces. En particular, Neisseria gonorrhoeae y Neisseria meningitidis causan patologías que podrían ser tratadas mediante vacunación.

Neisseria gonorrhoeae es el agente etiológico de la gonorrea, una de las enfermedades de transmisión sexual más frecuentemente indicadas en el mundo, con una incidencia anual estimada de 62 millones de casos (Gerbase et al 1998 Lancet 351; (Suppl 3) 2-4). Las manifestaciones clínicas de la gonorrea incluyen inflamación de las membranas mucosas del tracto urogenital, garganta o recto e infecciones oculares neonatales. Las infecciones gonocócicas ascendentes en las mujeres pueden conducir a infertilidad, embarazo ectópico, enfermedad inflamatoria pélvica crónica y formación de absceso tubo-ovárico. La septicemia, la artritis, la endocarditis y la meningitis están asociadas con la gonorrea complicada.

El alto número de cepas gonocócicas con resistencia a antibióticos contribuye a un aumento de la morbilidad y a complicaciones asociadas con la gonorrea. Una alternativa atractiva al tratamiento de la gonorrea con antibióticos sería su prevención usando vacunación. En la actualidad, no existe ninguna vacuna para infecciones de N. gonorrhoeae.

Neisseria meningitidis (meningococo) es una bacteria Gram-negativa aislada frecuentemente del tracto respiratorio superior humano. Ocasionalmente, causa enfermedades bacterianas invasivas, tales como bacteriemia y meningitis. La mayoría de los casos de la enfermedad se dan en bebés o niños pequeños. La incidencia de la enfermedad meningocócica muestra diferencias estacionales y anuales geográficas (Schwartz, B., Moore, P.S., Broome, C.V.; Clin. Microbiol. Rev. 2 (Suplemento), S18-S24, 1989). La mayor parte de la enfermedad en países de clima templado se debe a cepas del serogrupo B y su incidencia varía del 1-1/1. de población total al año, a veces alcanzando valores más altos (Kaczmarski, E.B. (1997), Commun. Dis. Rep. Rev. 7: R55-9,1995; Scholten, R.J.P.M., Bijlmer, H.A., Poolman, J.T. et al. Clin. Infect. Dis. 16: 237-246,1993; Cruz, C., Pavez, G., Aguilar, E., et al. Epidemiol. Infect. 15: 119-126,199).

Se encuentran epidemias dominadas por meningococos del serogrupo A, principalmente en África central, que a veces alcanzan niveles de hasta 1./1./año (Schwartz, B., Moore, P.S., Broome, C.V. Clin. Microbiol. Rev. 2 (Suplemento), S18-S24, 1989). Casi todos los casos, en conjunto, de la enfermedad meningocócica son causados por meningococos de los serogrupos A, B, C, W-135 e Y, y hay disponible una vacuna de polisacárido tetravalente A, C, W-135 e Y (Armand, J., Arminjon, F., Mynard, M.C., Lafaix, C., J. Biol. Stand. 1: 335-339,1982).

La frecuencia de las infecciones por Neisseria meningitidis ha aumentado dramáticamente en las últimas décadas. Esto se ha atribuido a la aparición de múltiples cepas resistentes a antibióticos y una población creciente de personas con sistemas inmunológicos debilitados. Ya no es raro aislar cepas de Neisseria meningitidis que son resistentes a algunos o a todos los antibióticos estándar. Este fenómeno ha creado una necesidad médica no satisfecha y la demanda de nuevos agentes antimicrobianos, vacunas, procedimientos de selección de medicamentos y ensayos de diagnóstico para este organismo.

Martin D et al Journal of Biotechnology 83 (2) 27-31 informa de que actualmente no existe ninguna vacuna eficaz que pueda estimular la inmunidad protectora común de grupo en los niños pequeños. Se están realizando esfuerzos para mejorar las vacunas de polisacáñdos actuales mediante conjugación a proteínas portadoras o para encontrar otros antígenos de superficie meningocócica que podrían convertirse en la base de una vacuna de proteína. Sin embargo, la variabilidad entre cepas de las proteínas principales de membrana externa restringiría su eficacia protectora a un número limitado de cepas relacionadas antigénicamente. La proteína de superficie A de Neisseria (denominada en la presente memoria NspA) tiene características que indican que es un potencial candidato de vacuna para el desarrollo de una vacuna común de grupo contra la enfermedad meningocócica.

Se prevé que la NspA recombinante expresada en células podría ser producida para su uso en dichos nuevos agentes antimicrobianos, vacunas, procedimientos de selección de fármacos y ensayos de diagnóstico. Sin embargo, una de las principales limitaciones en la expresión de proteínas es la incapacidad de muchas proteínas recombinantes para

plegarse a sus conformaciones biológicamente activas. Frecuentemente, sólo se obtienen bajos rendimientos de la proteína recombinante debido a la agregación y al plegamiento incorrecto de las especies no plegadas. De hecho, el replegamiento de proteínas, en el que la proteína adquiere su estructura nativa y activa, es uno de los mayores desafíos en la biología molecular. Jansen et al. (Biochim. et Biophys. Acta. Biomembranes, 2 1464:284-298) describe la caracterización de PorA de Neisseria menigitidis plegada in vitro.

Teniendo en cuenta los problemas asociados con la obtención de proteínas recombinantes replegadas, biológicamente activas, se ha previsto el uso de vectores no vivos, por ejemplo vesículas o "ampollas" bacterianas de membrana externa. Las ampollas OM se derivan de la membrana externa de la membrana de dos capas de bacterias Gram- negativas y se han documentado en muchas bacterias Gram negativas (Zhou, L et al. 1998. FEMS Microbiol. Lett. 163: 223-228). Sin embargo, las ampollas tienen la desventaja de que pueden expresar proteínas de la membrana externa que no son relevantes (por ejemplo, antígenos no protectores o proteínas inmunodominantes pero variables) o perjudiciales (por ejemplo, moléculas tóxicas tales como LPS, o inductores potenciales de una respuesta autoinmune). Por lo tanto, sigue existiendo la necesidad de proporcionar una vacuna de subunidades contra la enfermedad por Neisseria que comprenda proteínas de membrana externa protectoras purificadas en una conformación replegada adecuada para provocar una respuesta inmune efectiva.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona un procedimiento mejorado para el replegamiento de la proteína NspA. Los presentes inventores han demostrado ahora que es posible aumentar la recuperación de proteína activa a partir de cuerpos de inclusión parcialmente purificados en cantidades de hasta el 1%, sin la necesidad de purificación adicional.

La presente divulgación se refiere a la proteína NspA replegada y a procedimientos para el uso de dichas proteínas, incluyendo la prevención y el tratamiento de enfermedades microbianas, entre otras, por ejemplo, en vacunas de subunidades. En un aspecto adicional, la divulgación se refiere a ensayos de diagnóstico para detectar enfermedades asociadas con infecciones microbianas y afecciones asociadas con dichas infecciones.

Declaraciones de la invención

Según un aspecto de la presente invención, se proporciona un procedimiento de replegamiento de la proteína NspA que comprende poner en contacto la proteína NspA con un tampón de replegamiento alcalino que comprende 3- dimetildodecilamoniopropanosulfonato (en adelante, en la presente memoria, denominado también SB-12).

Preferentemente, el tampón de replegamiento comprende etanolamina y SB-12.

Preferentemente, el tampón de replegamiento tiene pH 11.

Preferentemente, el SB-12 es SB-12 al ,2-1% o ,3-,8%.

Preferentemente, el SB-12 es SB-12 al ,2%.

En otra realización preferente, el SB-12 es SB-12 al ,5%.

En otra realización preferente, el SB-12 es SB-12 al 1%.

Preferentemente, el SB-12 está purificado.

Preferentemente, el SB-12 es purificado pasándolo por una columna de AI2O3.

Preferentemente, la etanolamina es etanolamina de aproximadamente 2 mM (más preferentemente de aproximadamente pH 11).

Según otro aspecto de la presente invención, se proporciona un procedimiento que comprende las etapas siguientes:... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento de replegamiento de una proteína NspA que comprende poner en contacto la proteína NspA con un tampón de replegamiento alcalino que comprende 3-dimetildodecilamoniopropanosulfonato (SB-12).

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el tampón de replegamiento comprende etanolamina y SB-12.

3. Procedimiento según la reivindicación 2, en el que la etanolamina es etanolamina 2 mM.

4. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el tampón de replegamiento tiene pH11.

5. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que SB-12 es SB-12 al ,2%.

6. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el SB-12 es SB-12 al ,5%.

7. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el SB-12 está purificado.

8. Procedimiento según la reivindicación 7, en el que el SB-12 es purificado haciéndolo pasar sobre una columna de

AL23.

9. Un procedimiento que comprende las etapas siguientes:

a. expresar una proteína NspA en una célula huésped;

b. romper la célula huésped para obtener un cuerpo de inclusión que comprende la proteína NspA;

c. lavar el cuerpo de inclusión;

d. solubilizar al menos parte del cuerpo de inclusión y la proteína NspA;

e. poner en contacto la proteína NspA solubilizada con el tampón de replegamiento de las reivindicaciones 1 -8; y

f. eliminar el tampón de replegamiento de la proteína NspA.