Ratones transgénicos que expresan VEGF humanizado.

Un ratón transgénico que expresa VEGF hum-X, de acuerdo con SEC ID Nº:

12, en donde el ratón es homocigoto para la disrupción funcional del alelo de VEGF endógeno mediante integración homóloga de ácido nucleico que codifica VEGF hum-X (SEC ID Nº: 12), y por tanto no expresa VEGF endógeno.

Ratones transgénicos que expresan VEGF humanizado Campo de la invención La presente invención se refiere, en general, a animales transgénicos también útiles para estudiar terapias relacionadas con VEGF. En concreto, la invención se refiere a animales transgénicos con VEGF humanizado y no humanos que lo expresan.

Antecedentes de la invención La angiogénesis es un suceso celular importante en el que las células endoteliales proliferan, se cortan y reorganizan para formar vasos a partir de la red vascular preexistente. Hay pruebas convincentes de que el desarrollo de un suministro vascular es esencial para procesos proliferativos normales y patológicos (Folkman y Klagsbrun (1987) Science 235:442-447) . La angiogénesis también está implicada en la patogénesis de verios trastornos incluyendo, pero sin limitación, tumores, retinopatías proliferativas, degeneración macular asociada a la edad, artritis reumatoide (AR) y psoriasis. La angiogénesis es esencial para el crecimiento de la mayoría de tumores primarios y su posterior metástasis.

A la vista de la destacable importancia fisiológica y patológica de la angiogénesis, se ha dedicado mucho trabajo a la dilucidación de los factores capaces de regular este proceso. Se sugiere que el proceso de angiogénesis se regula por un equilibrio entre moléculas pro-y anti-angiogénicas, y está desajustada en varias enfermedades, especialmente en cáncer. Carmeliet y Jain (2000) Nature 407:249-257.

Se ha informado que el factor de crecimiento de células endoteliales vasculares (VEGF) , que también se llama VEGF-A o factor de permeabilidad vascular (VPF) , es un regulador fundamental de la angiogénesis tanto normal como anormal. Ferrara y Davis-Smyth (1997) Endocrine Rev. 18:4-25; Ferrara (1999) J. Mol. Med. 77:527-543. En comparación con otros factores de crecimiento que contribuyen a los procesos de formación vascular, VEGF es único en su elevada especificidad para células endoteliales en el sistema vascular. VEGF es esencial para la vasculogénesis y angiogénesis embrionaria. Carmeliet et al. (1996) Nature 380:435-439; Ferrara et al. (1996) Nature 380:439-442. Además, se necesita VEGF para la proliferación cíclica de los vasos sanguíneos en el tracto reproductivo femenino y para el crecimiento óseo y formación de cartílago. Ferrara et al. (1998) Nature Med. 4:336340; Gerber et al. (1999) Nature Med. 5:623-628.

Además de ser un factor angiogénico en la angiogénesis y vasculogénesis, VEGF, como factor de crecimiento pleiotrópico, muestra múltiples efectos biológicos en otros procesos fisiológicos, como supervivencia de células endoteliales, permeabilidad vascular y vasodilatación, quimiostasis de monocitos y entrada de calcio. Ferrara y Davis-Smyth (1997) , anteriormente citado. Además, se ha comunicado en estudios recientes el efecto mitogénico de VEGF en unos pocos tipos de células no endoteliales, como células epiteliales de pigmento retiniano, células de los conductos pancreáticos y células de Schwann. Guerrin et al. (1995) J. Cell Physiol. 164:385-394; Oberg-Welsh et al. (1997) Mol. Cell. Endocrinol. 126:125-132; Sondell et al. (1999) J. Neurosci. 19:5731-5740.

Pruebas sustanciales también implican el papel crucial de VEGF en el desarrollo de afecciones o enfermedades que incluyen angiogénesis patológica. El ARN de VEGF se sobreexpresa por la mayoría de tumores humanos examinados (Berkman et al. J Clin Invest 91:153-159 (1993) ; Brown et al. Human Pathol.. 26:86-91 (1995) ; Brown et al. Cancer Res. 53:4727-4735 (1993) ; Mattern et al. Brit. J. Cancer. 73:931-934 (1996) ; y Dvorak et al. Am J. Pathol. 146:1029-1039 (1995) ) . También, la concentración de VEGF en fluidos oculares está muy correlacionada con la presencia de proliferación activa de vasos sanguíneos en pacientes con retinopatía diabética y otras retinopatías asociadas a isquemia (Aiello et al. N. Engl. J. Med. 331:1480-1487 (1994) ) . Además, los estudios han demostrado la localización de VEGF en membranas neovasculares coroidales en pacientes afectados por DMAE (Lopez et al. Invest. Ophtalmo. Vis. Sci. 37:855-868 (1996) ) .

Debido a su papel principal en la promoción del crecimiento tumoral, VEGF proporciona una diana atractiva para intervención terapéutica. De hecho, se están desarrollando verias estrategias terapéuticas dirigidas a bloquear VEGF o su sistema de señalización de receptor para el tratamiento de enfermedades neoplásicas. Rosen (2000) Oncologist 5:20-27; Ellis et al. (2000) Oncologist 5:11-15; Kerbel (2001) J. Clin. Oncol. 19: 45S-51S. El anticuerpo anti VEGF "bevacizumab", también conocido como "rhuMAb VEGF" o "Avastin®", es un anticuerpo monoclonal anti VEGF recombinante humanizado generado de acuerdo con Presta et al. (1997) Cancer Res. 57:4593-4599. Bevacizumab está aprobado para el tratamiento del cáncer colorrectal metastásico y cáncer microcítico de pulmón y se está investigando clínicamente para tratar varios otros cánceres.

A pesar de los papeles significativos de VEGF en la angiogénesis normal y patológica, se carece de modelos animales que puedan usarse para estudiar el VEGF humano. Por tanto, existe una necesidad para modelos animales relevantes para el estudio de enfermedades y desarrollo de fármacos.

Sumario de la invención La invención proporciona un ratón transgénico que expresa VEGF humanizado, según se define en las reivindicaciones.

La invención también proporciona una célula o tejido derivado del ratón transgénico de la invención.

La invención también proporciona métodos y usos relacionados, también definidos en las reivindicaciones.

También se divulgan a continuación otros animales transgénicos que expresan VEGF humanizado o de humano, incluyendo ratones que expresan otro VEGF humanizado o VEGF humano, y materia objeto relacionada.

También se divulgan a continuación ácidos nucleicos que codifican determinados VEGF humanos, polipéptidos codificados de este modo, y vectores relacionados, células hospedadoras y métodos de producción.

Breve descripción de las figuras La Figura 1A muestra una comparación de secuencias entre VEGF-A de ratón (SEC ID Nº : 1) y humano (SEC ID Nº : 2) . Los aminoácidos que son distintos entre VEGF164 murino y VEGF165 humano están sombreados en gris. Se mutaron 10 aminoácidos (recuadrados y en gris) de VEGF de ratón a los restos de humano mediante mutagénesis dirigida para generar la secuencia de VEGF hum-X. La Figura 1B muestra una representación esquemática de los vectores de direccionamiento para generar ratones knock-in (ki) hum-I y hum-X. Las mutaciones se introdujeron en los exones 3 a 5 de los vectores de direccionamiento, dando como resultado ratones que expresaban la forma de VEGF hum-I o hum-X. La proteína VEGF hum-I consiste en la mutación muVEGF-S87G. La proteína VEGF hum-X consiste en las mutaciones siguientes: muVEGF-R26H, A57G, A64G, S71E, S87G, S99N, R100K, T110A, K111R, P112Q. Esta nomenclatura parte de la secuencia madura. La Figura 2A muestra las curvas de crecimiento de tumores Calu-6. El tratamiento comenzó tres días después de la implantación bien con Mab control, B20-4.1, G6-31, bevacizumab o Y0317 (5 mg/kg, IP, dos veces a la semana) La Figura 2B muestra los pesos de tumores terminales de tumores Calu-6 en el día 64 de tratamiento como se describe en la Figura 2A. Los tumores tratados con B20-4.1 y G6-31 fueron significativamente más pequeños que los tratados con bevacizumab. La Figura 2C muestra las curvas de crecimiento de células de carcinoma colorrectal humano (HT29) tratadas en el día 3 tras la implantación con bien con control, B20-4.1, G6-31, bevacizumab o Y0317 (5 mg/kg dos veces a la semana, IP) . Los tumores tratados con B20-4.1 y G6-31 fueron significativamente más pequeños en relación a los tumores tratados con bevacizumab a determinados puntos de tiempo durante el tratamiento. La Figura 2D muestra los pesos de los tumores terminales de tumores de HT29 en el día 67 del tratamiento como se describe en la Figura 2C. La Figura 2E muestra las curvas de crecimiento tumoral de tumores de Calu-6 tratados después de que los volúmenes tumorales alcanzasen 500 mm3 (experimento de regresión) bien con control, B20-4.1, G6-31, bevacizumab o Y0317 Mab (5 mg/kg, IP, dos veces a la semana) . Los tumores tratados con B20-4.1 y G6-31 fueron significativamente más pequeños que los tumores tratados con bevacizumab. La Figura 2F muestra los pesos de los tumores terminales de tumores de Calu-6 en el día 63 de tratamiento con varios Mab anti VEGF. Los tumores tratados con B20-4.1 y G6-31 mostraron un peso significativamente reducido en comparación con los tumores tratados con bevacizumab. La Figura 2G muestra las curvas de crecimiento tumoral de tumores humanos colorrectales (HM7) tratados... [Seguir leyendo]

1. Un ratón transgénico que expresa VEGF hum-X, de acuerdo con SEC ID Nº : 12, en donde el ratón es homocigoto para la disrupción funcional del alelo de VEGF endógeno mediante integración homóloga de ácido nucleico que 5 codifica VEGF hum-X (SEC ID Nº : 12) , y por tanto no expresa VEGF endógeno.

2. El ratón transgénico de la reivindicación 1, el cual carece de RAG2 murino.

3. Una célula o un tejido derivados del ratón transgénico de la reivindicación 1 o de la reivindicación 2. 10

4. Un método para identificar un compuesto como un posible agente para tratar una enfermedad mediada por VEGF, comprendiendo dicho método:

a) medir el nivel de VEGF en el ratón transgénico de la reivindicación 1 o de la reivindicación 2; 15 b) administrar dicho compuesto al ratón; y c) medir el nivel de VEGF en el ratón;

en donde una alteración en el nivel de VEGF tras la administración del agente identifica el compuesto como un posible agente para tratar una enfermedad mediada por VEGF. 20

5. Un método para identificar un antagonista de VEGF como un posible agente para tratar un cáncer humano, comprendiendo dicho método:

a) administrar dicho agente al ratón transgénico de la reivindicación 1 o de la reivindicación 2, en donde dicho 25 ratón tiene un xenoinjerto de tumor de células cancerosas; y b) evaluar el crecimiento de dicho xenoinjerto;

en donde una reducción en la tasa de crecimiento o en el tamaño de dicho xenoinjerto identifica al antagonista de VEGF como un posible agente para tratar un cáncer humano. 30

6. Un método para ensayar la seguridad de un antagonista de VEGF, comprendiendo dicho método:

a) administrar dicho antagonista de VEGF al ratón transgénico de las reivindicaciones 1 o 2; y b) evaluar al ratón para efectos adversos a corto o largo plazo. 35

7. El método de la reivindicación 5 o de la reivindicación 6, en donde dicho antagonista de VEGF es un anticuerpo anti VEGF o un fragmento de unión a antígeno del mismo, una molécula de receptor de VEGF o un derivado que se une específicamente a VEGF secuestrando de esta manera su unión a uno o más receptores de VEGF, o un anticuerpo anti receptor de VEGF.

8. El método de las reivindicaciones 5 o 6, en donde dicho antagonista de VEGF es un anticuerpo.

9. El uso de un ratón transgénico de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2 para estudiar las

propiedades de seguridad de una terapia dirigida a VEGF. 45