Purificación de vesículas bacterianas.

Un procedimiento de purificación de vesículas bacterianas inmunogénicas,

obtenidas por la alteración o vesiculación de la membrana externa de bacterias, a partir de una composición que incluye tanto bacterias completas como las vesículas obtenidas a partir de las mismas, que comprende: (i) una primera etapa de filtración en la que las vesículas se separan de las bacterias basándose en sus diferentes tamaños, pasando las vesículas al filtrado; y (ii) una segunda etapa de filtración en la que las vesículas son retenidas en el concentrado.

Purificación de vesículas bacterianas.

CAMPO TÉCNICO

La presente invención está en el campo de purificar vesículas de bacterias Gram-negativas.

TÉCNICA ANTERIOR

Las bacterias Gram-negativas pueden liberar espontáneamente ampollas de la membrana externa durante el crecimiento debido a la presión de turgencia de la envoltura de la célula. La formación de tales ampollas puede facilitarse por la alteración de ciertos componentes bacterianos, por ejemplo, las referencias 1 y 2 alteraron la enzima MltA de meningococo proporcionando cepas que liberan vesículas en el medio de cultivo durante el crecimiento, y las referencias 2 y 3 alteraron el sistema Tol-Pal de E. coli para el mismo fin.

Las vesículas de la membrana externa (VME) también pueden producirse por alteración de la bacteria completa. Procedimientos de producción de VME conocidos incluyen procedimientos que usan tratamiento con detergente (por ejemplo, con desoxicolato) [4 y 5], procedimientos sin detergente [6], o sonicación [7], etc.

Se han usado diversos procedimientos para purificar estas vesículas inmunogénicas (es decir, ampollas y VME) . Por ejemplo, la referencia 8 informa de un procedimiento basado en ultrafiltración.

Aunque eficaces, estos procedimientos requieren mucho trabajo y son caros, particularmente debido al uso de centrifugación. Así, los procedimientos no son adecuados para la producción de vacunas de bajo coste contra enfermedades que son comunes en países en desarrollo, por ejemplo, contra shigelosis. Así, existe la necesidad de un procedimiento más simple y más barato para la purificación de vesículas bacterianas inmunogénicas.

DIVULGACIÓN DE LA INVENCIÓN

La invención usa un procedimiento de filtración por tamaño de dos etapas para purificar vesículas bacterianas inmunogénicas. Una primera etapa separa las vesículas de bacterias intactas basándose en sus diferentes tamaños, pasando las vesículas más pequeñas al filtrado (permeado) . Entonces, una segunda etapa usa un filtro más fino para eliminar contaminantes más pequeños (por ejemplo, proteínas solubles) , quedando las vesículas en el concentrado. Este procedimiento de dos etapas es extremadamente simple de operar, pero da vesículas inmunogénicas de alta pureza.

Así, la invención proporciona un procedimiento para purificar vesículas bacterianas inmunogénicas de una composición que incluye tanto bacterias como vesículas completas, que comprende: (i) una primera etapa de filtración en la que las vesículas se separan de las bacterias basándose en sus diferentes tamaños, pasando las vesículas al filtrado; y (ii) una segunda etapa de filtración en la que las vesículas son retenidas en el concentrado. Las vesículas retenidas pueden usarse como componente inmunogénico en una vacuna.

La invención también proporciona una composición que contiene vesícula obtenida u obtenible por este procedimiento.

La invención también proporciona un procedimiento para preparar una composición farmacéutica, tal como una vacuna, que comprende las etapas: (a) purificar vesículas bacterianas inmunogénicas mediante un procedimiento de la invención; y (b) formular las vesículas purificadas con un vehículo farmacéuticamente aceptable (por ejemplo, un tampón) y/o con un adyuvante inmunológico y/o con uno o más componentes adicionalmente inmunogénicos.

La invención también proporciona un procedimiento para preparar una composición farmacéutica, tal como una vacuna, que comprende una etapa de formular vesículas purificadas mediante un procedimiento de la invención con un vehículo farmacéuticamente aceptable (por ejemplo, un tampón) y/o con un adyuvante inmunológico y/o con uno o más componentes adicionalmente inmunogénicos.

La invención también proporciona una composición farmacéutica que contiene vesículas obtenidas u obtenibles por estos procedimientos.

Las vesículas La invención puede usarse para purificar diversos tipos de vesículas proteoliposómicas que retienen proteínas de la membrana externa de bacterias. Esta vesícula proteoliposómica puede obtenerse por alteración o vesiculación de la membrana externa de una bacteria para formar vesículas a partir de la misma que incluyen componentes de proteína de la membrana externa. Así, el término incluye VME, ampollas, microvesículas (MV [9]) y 'VME nativas' ('VMEN' [10]) . También puede incluir VME extraídas con detergente (VMED) y VME derivadas de mutante (VME-m) .

Ampollas, MV y VMEN son vesículas de membrana que se producen naturalmente que se forman espontáneamente durante el crecimiento bacteriano y son liberadas al medio de cultivo. Las MV pueden obtenerse cultivando bacterias tales como Neisseria en medio de cultivo de caldo, separando células completas de las MV más pequeñas en el medio de cultivo de caldo (por ejemplo, por filtración o por centrifugación a baja velocidad para sedimentar solo las células y no las vesículas más pequeñas) , y luego recogiendo las MV del medio agotado en células (por ejemplo, por filtración, por precipitación diferencial o agregación de MV, por centrifugación a alta velocidad para sedimentar las MV) . Cepas para su uso en la producción de MV pueden seleccionarse generalmente basándose en la cantidad de MV producidas en cultivo, por ejemplo, las ref. 11 y 12 describen Neisseria con alta producción de MV. La hipervesiculación de cepas se desvela en la referencia 13. La alteración del gen mltA [1, 2] también puede proporcionar cepas meningocócicas que liberan espontáneamente vesículas adecuadas durante el cultivo. La alteración del sistema Tol-Pal puede usarse para proporcionar cepas de E. coli, Shigella y Salmonella que liberan espontáneamente vesículas adecuadas durante el cultivo.

Las VME se preparan artificialmente a partir de bacterias, y pueden prepararse usando tratamiento con detergente (por ejemplo, con desoxicolato o sarcosilo) , o por medios sin detergente (por ejemplo, véase la referencia 14) . Técnicas para formar VME incluyen tratar bacterias con un detergente de sal de ácido biliar (por ejemplo, sales de ácido litocólico, ácido quenodesoxicólico, ácido ursodesoxicólico, ácido desoxicólico, ácido cólico, ácido ursocólico, etc., siendo preferido el desoxicolato de sodio [15 y 16] para tratar Neisseria) a un pH suficientemente alto para no precipitar el detergente [17]. Otras técnicas pueden realizarse sustancialmente en ausencia de detergente [14] usando técnicas tales como sonicación, homogeneización, microfluidización, cavitación, choque osmótico, molienda, prensa francesa, mezcla, etc. Procedimientos que no usan detergente o poco detergente pueden retener antígenos útiles tales como NspA [14]. Así un procedimiento puede usar un tampón de extracción de VME con aproximadamente el 0, 5 % de desoxicolato o menos, por ejemplo, aproximadamente el 0, 2 %, aproximadamente el 0, 1 %, <0, 05 % o cero.

Un procedimiento útil para la preparación de VME se describe en la referencia 18 e implica ultrafiltración sobre VME en brutas, en vez de en lugar de centrifugación a alta velocidad. El procedimiento puede implicar una etapa de ultracentrifugación después de tener lugar la ultrafiltración.

Si LOS está presente en una vesícula es posible tratar la vesícula de manera que enlace su LOS y componentes de proteína (conjugación “intra-ampollas” [19]) .

Vesículas preferidas para su uso con la invención se producen por una bacteria Shigella (por ejemplo, una S. sonnei) que no expresa una proteína TolR funcional. Otras vesículas para su uso con la invención se producen por una bacteria Salmonella (por ejemplo, una S. typhimurium, también conocida como Salmonella enterica serovariedad Typhimurium) que no expresa una proteína TolR funcional.

La bacteria La invención puede usarse para purificar vesículas de diversas bacterias Gram-negativas tales como especies en cualquiera de los géneros Escherichia, Shigella, Neisseria, Moraxella, Bordetella, Borrelia, Brucella, Chlamydia Haemophilus, Legionella, Pseudomonas, Yersinia, Helicobacter, Salmonella, Vibrio, etc.

Por ejemplo, la bacteria puede ser Bordetella pertussis, Borrelia burgdorferi, Brucella melitensis, Brucella ovis, Chlamydia psittaci, Chlamydia trachomatis, Moraxella catarrhalis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae (incluyendo cepas no tipables) , Legionella pneumophila, Neisseria gonorrhoea, Neisseria meningitidis, Neisseria lactamica, Pseudomonas aeruginosa, Yersinia enterocolitica, Helicobacter pylori, Salmonella enterica (incluyendo las serovariedades typhi y typhimurium, además de las serovariedades paratyphi y enteritidis) , Vibrio cholerae, etc.

La invención es particularmente... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento de purificación de vesículas bacterianas inmunogénicas, obtenidas por la alteración o vesiculación de la membrana externa de bacterias, a partir de una composición que incluye tanto bacterias completas como las vesículas obtenidas a partir de las mismas, que comprende: (i) una primera etapa de filtración en la que las vesículas se separan de las bacterias basándose en sus diferentes tamaños, pasando las vesículas al filtrado; y (ii) una segunda etapa de filtración en la que las vesículas son retenidas en el concentrado.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la primera etapa de filtración es una microfiltración en 0, 22 µm.

3. El procedimiento de cualquier reivindicación precedente, en el que la primera filtración es una filtración de flujo tangencial.

4. El procedimiento de cualquier reivindicación precedente, en el que la segunda filtración es una microfiltración en 0, 1 µm

5. El procedimiento de cualquier reivindicación precedente, en el que la segunda filtración es una filtración de flujo tangencial.

6. El procedimiento de cualquier reivindicación precedente, en el que las bacterias son Shigella.

7. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que las bacterias son Salmonella.

8. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que las bacterias son E. coli.

9. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que las bacterias son Haemophilus influenzae.

10. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que las bacterias son Neisseria meningitidis.

11. El procedimiento de cualquier reivindicación precedente, que comprende además una etapa en la que las vesículas purificadas se formulan como una vacuna.

12. Un procedimiento de preparación de una composición farmacéutica, que comprende la formulación de vesículas purificadas mediante un procedimiento de cualquier reivindicación precedente con uno o más de: un vehículo farmacéuticamente aceptable; adyuvante inmunológico; o uno o más componentes adicionalmente inmunogénicos.

13. El procedimiento de la reivindicación 12, en el que la composición farmacéutica es una vacuna.