Purificación de anticuerpos mediante cromatografía de intercambio catiónico.

Un método para purificar un anticuerpo de una composición que comprende el anticuerpo y al menos un contaminante,

comprendiendo dicho método las etapas secuenciales de:

(a) cargar la composición en un material de intercambio catiónico en donde la composición está a un primer pH de 4,0 a 6,0;

(b) lavar el material de intercambio catiónico con un primer tampón de lavado, en donde el pH del primer tampón de lavado es de 6,8 a 9,0;

(c) lavar el material de intercambio catiónico con un segundo tampón de lavado de un pH de 5,0 a 6,0; y

(d) eluir el anticuerpo del material de intercambio catiónico con un tampón de elución a una conductividad que es al menos 2 mS/cm mayor que la del segundo tampón de lavado.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US2008/081516.

Solicitante: GENENTECH, INC..

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: 1 DNA WAY SOUTH SAN FRANCISCO, CA 94080 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: LEBRETON,BENEDICTE ANDREE, O\'CONNOR,DEBORAH ANN, SAFTA,AURELIA, SHARMA,MANDAKINI.

Fecha de Publicación: 31 de Diciembre de 2014.

Clasificación Internacional de Patentes:

C07K1/18 QUIMICA; METALURGIA. › C07 QUIMICA ORGANICA. › C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02; proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 1/00 Procedimientos generales de preparación de péptidos. › Cromatografía de intercambio iónico.
C07K16/06 C07K […] › C07K 16/00 Inmunoglobulinas, p. ej. anticuerpos mono o policlonales. › del suero.
C07K16/22 C07K 16/00 […] › contra factores de crecimiento.
C07K16/28 C07K 16/00 […] › contra receptores, antígenos celulares de superficie o determinantes celulares de superficie.

PDF original: ES-2533266_T3.pdf

Fragmento de la descripción:

Purificación de anticuerpos mediante cromatografía de intercambio catiónico Solicitudes relacionadas Antecedentes de la invención Campo de la invención

invención se refiere a un menos un contaminante alto pH para retirar los

contaminantes antes de eluir el anticuerpo deseado usando un tampón de elución con conductividad aumentada. Descripción de la técnica relacionada

La purificación económica a gran escala de proteínas es un problema cada vez más importante para la industria de biotecnología. Generalmente, las proteínas se producen por cultivo celular, usando líneas celulares eucariotas o procariotas modificadas por ingeniería para producir la proteína de interés por inserción de un plásmido recombinante que contiene el gen para esa proteína. Como las células normalmente usadas son organismos vivos, deben alimentarse con un medio de crecimiento complejo, que contiene azúcares, aminoácidos, y factores de crecimiento, habitualmente suministrados a partir de preparaciones de suero animal. La separación de la proteína deseada de la mezcla de compuestos suministrados a las células y de los subproductos de las propias células a una pureza suficiente para su uso como agente terapéutico humano supone un reto formidable.

Los procedimientos para la purificación de proteínas de los desechos celulares inicialmente dependen de la expresión de la proteína. Algunas proteínas pueden encapsularse para secretarse desde la célula al medio de cultivo adyacente; otras pueden prepararse de forma intracelular. Para las últimas proteínas, la primera etapa de un proceso de purificación implica la lisis de la célula, que puede hacerse mediante diversos métodos, incluyendo corte mecánico, choque osmótico, o tratamientos enzimáticos. Dicha alteración libera los contenidos completos de la célula en el homogeneizado, y además produce fragmentos subcelulares que son difíciles de retirar debido a su pequeño tamaño. Estos generalmente se retiran por centrifugación diferencial o por filtración. El mismo problema surge, aunque a menor escala, con proteínas secretadas directamente debido a la muerte natural de las células y liberación de las proteínas intracelulares de la célula hospedadora en el trascurso del proceso de producción de proteínas.

Una vez se ha obtenido una solución aclarada que contiene la proteína de interés, su separación de las otras proteínas producidas por la célula se intenta habitualmente usando una combinación de diferentes técnicas de cromatografía. Estas técnicas separan mezclas de proteínas basándose en su carga, grado de hidrofobicidad, o tamaño. Están disponibles varias resinas de cromatografía diferentes para cada una de estas técnicas, que permiten la adaptación precisa del esquema de purificación a la proteína particular implicada. La esencia de cada uno de estos métodos de separación es que puede causarse que las proteínas se muevan a diferentes velocidades a lo largo de una columna, consiguiendo una separación física que aumenta según pasan bajando por la columna, o se adhieran selectivamente al medio de separación, eluyéndose entonces de forma diferencial por diferentes disolventes. En algunos casos, la proteína deseada se separa de las impurezas cuando las impurezas se adhieren específicamente a la columna, y la proteína de interés no, es decir, la proteína de interés está presente en el "flujo continuo".

La cromatografía de intercambio iónico es una técnica cromatográfica que se usa habitualmente para la purificación de proteínas. En cromatografía de intercambio iónico, parches cargados sobre la superficie del soluto se atraen por cargas opuestas unidas a la matriz de cromatografía, con la condición de que la fuerza iónica del tampón que rodea sea baja. La elución se consigue generalmente aumentando la fuerza iónica (es decir la conductividad) del tampón para competir con el soluto por los sitios cargados de la matriz de intercambio iónico. Cambiar el pH y de ese modo alter la carga del soluto es otro modo de conseguir la elución del soluto. El cambio en la conductividad o pH puede ser gradual (elución en gradiente) o por etapas (elución en etapas). En el pasado, estos cambios han sido progresivos; es decir, el pH o la conductividad se aumenta o disminuye en una única dirección

Las patentes de Estados Unidos N2 6.339.142, 6.417.355, 6.489.447, y 7.74.44 (Basey et al.) describen cromatografía de intercambio iónico para purificar polipéptidos. Las patentes de Estados Unidos N2 6.127.526, 6.333.398, y 6.797.814 (Blank, G.) describen purificación de proteínas, tales como anticuerpos anti-HER2, por cromatografía en proteína A. Los métodos para purificar proteínas, tales como anticuerpos, por cromatografía de intercambio iónico se describen en la publicación de solicitud de Estados Unidos N2 24/8247.

La patente de Estados Unidos N2 5.11.913 se refiere a la purificación de un anticuerpo en una solución acuosa uniendo el anticuerpo a una resina de intercambio iónico a un primer pH de 4,6, lavando a un segundo pH de 5,5, y

Esta invención se refiere en líneas generales a la purificación de proteínas. En particular, la método para purificar anticuerpos de una composición que comprende el anticuerpo y al usando cromatografía de intercambio catiónico, donde se usa una etapa de lavado a

eluyendo el anticuerpo a pH 6,5, donde la fuerza iónica de las soluciones de estas tres etapas permanece constante. Zhang et al. se refieren a cromatografía de intercambio aniónico en membrana Q de un anticuerpo humano (Zhang et al. "Q Membrane Chromatography Application for Human Antibody Purification Process," Póster presentado en BioProduction, Oct. 26-27, Múnich, Alemania, 24). Otras publicaciones referentes a la purificación de proteínas incluyen: Barnthouse et al. J. Biotech. 66: 125-136 (1998); Blank et al. Bioseparation 1: 65-71 (21); Follman y Fahrner J. Chromatog. 124: 79-85 (24); lyer et al. BioPharm 15(1 ):14-16, 18, 2, 53 (22); documento US 24/8247A1; documento EP 333.574; documento EP 46.426 B1; documento EP 556.83; documento WO 89/5157; documento WO 92/22653; documento WO 93/6217;

96/3328;

5.11.913

5.169.774

5.429.746

6.5.81

6.339.142

documento

96/4883;

5.112.951

5.196.323

5.451.662

6.54.561

documento

4.753.894;

5.115.11

5.256.769

5.525.338

6.127.526

documento

95/22389;

4.966.851;

5.118.796;

5.279.823;

5.677.171;

6.267.958;

documento WO documento US documento documento documento documento

documento US 6.417.335; documento US 6.489.447; Adachi et al., Journal of Chromatography. A. 763 (1- 2): 57-63 (Feb 28, 1997); Gagnon, P. Purification Tools for Monoclonal Antibodies, Tucson: Validated Biosystems, Inc., Capítulo 4, pág. 57-86 (1996); Graf et al., Bioseparation 4(1):7-2 (Feb 1994); Mhatre et al., Journal of Chromatography A 77(2):225-231 (Jul 21, 1995); Neidhardt et al., Journal of Chromatography 59(2): 255-261 (1992); Protein Purification Applications - A Practical Approach, Harris y Angal, IRL Press pág. 151-156 (1995); Sofer et al. Handbook of Process Chromatography: A Guide to Optimization, Scale-up, and Validation, San Diego: Academic Press pág. 65-8 (1997); Tishchenko et al., Journal of Chromatography B 76(1 ):157-166 (Feb 27, 1998).

Sumario de la invención

La invención de este documento se refiere a un método mejorado para cromatografía de intercambio catiónico de anticuerpos en que se usa una etapa de lavado a alto pH para retirar los contaminantes antes de eluir el producto deseado de anticuerpo. El proceso provoca, entre otras cosas, una eliminación mejorada de contaminantes de proteínas de ovario de hámster chino (CHOP).

De acuerdo con un primer aspecto, la invención proporciona un método para purificar un anticuerpo de una composición que comprende el anticuerpo y al menos un contaminante, comprendiendo dicho método las etapas secuenciales de:

(a) cargar la composición en un material de intercambio catiónico donde la composición está a un primer pH de 4, a 6,;

(b) lavar el material de intercambio catiónico con un primer tampón de lavado a un pH que es mayor que el de la composición en (a),... [Seguir leyendo]

Reivindicaciones:

1. Un método para purificar un anticuerpo de una composición que comprende el anticuerpo y al menos un contaminante, comprendiendo dicho método las etapas secuenciales de:

(a) cargar la composición en un material de intercambio catiónico en donde la composición está a un primer pH de 4, a 6,;

(b) lavar el material de intercambio catiónico con un primer tampón de lavado, en donde el pH del primer tampón de lavado es de 6,8 a 9,;

(d) eluir el anticuerpo del material de intercambio catiónico con un tampón de elución a una conductividad que es al menos 2 mS/cm mayor que la del segundo tampón de lavado.

2. El método de la reivindicación 1, en el que el pH del segundo tampón de lavado y el pH del tampón de elución son aproximadamente ¡guales.

3. El método de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo se une a CD2 humana.

4. El método de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo se une al factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF).

5. El método de la reivindicación 1, en el que el pH de la composición en (a) es de 4, a 6,, el pH del primer tampón

de lavado es de 6,8 a 8,, el pH del segundo tampón de lavado es de 5, a 6,, y el pH del tampón de elución es de

5, a 6,.

6. El método de la reivindicación 1, en el que la conductividad del tampón de elución es de 1 mS/cm a 1 mS/cm.

7. El método de la reivindicación 1, en el que el tampón de elución comprende NaC11 a 3 mM.

8. El método de la reivindicación 1, en el que el material de intercambio catiónico comprende partículas de flujo continuo de poli(estireno-divinilbenceno) reticulado recubiertas con un polímero polihidroxilado funcionalizado con grupos sulfopropilo.

9. El método de la reivindicación 1, en el que el contaminante se selecciona entre el grupo que consiste en proteínas de ovario de hámster chino (CHOP), proteína A lixiviada, ADN, anticuerpo agregado, componente de medio de cultivo celular, garamicina y contaminante viral.

1. Un método para purificar un anticuerpo que se une a CD2 humana de una composición que comprende el anticuerpo y uno o más contaminantes seleccionados entre el grupo que consiste en proteínas de ovario de hámster chino (CHOP), proteína A lixiviada, ADN y anticuerpo contra CD2 agregado, comprendiendo dicho método las etapas secuenciales de:

(a) cargar la composición en un material de intercambio catiónico en donde la composición está a un pH de 4, a

6,;

(b) lavar el material de intercambio catiónico con un primer tampón de lavado a un pH de 6,8 a 9,;

(d) eluir el anticuerpo del material de Intercambio catiónico usando un tampón de elución con un pH de 5, a 6, y una conductividad de 1 mS/cm a 1 mS/cm.

11. El método de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo es rituximab.

12. El método de la reivindicación 1, en el que el tampón de elución comprende NaC11 a 3 mM.

13. Un método para purificar un anticuerpo que se une al factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) de una composición que comprende el anticuerpo y uno o más contaminantes seleccionados entre el grupo que consiste en una componente de medio de cultivo celular, garamicina, proteínas de ovario de hámster chino (CHOP), ADN, contaminante viral y anticuerpo contra VEGF agregado, comprendiendo dicho método las etapas secuenciales de:

(a) cargar la composición en un material de intercambio catiónico en donde la composición está a un pH de 4, a

6,;

(b) lavar el material de intercambio catiónico con un primer tampón de lavado a un pH de 6,8 a 8,;

(d) eluir el anticuerpo del material de intercambio catiónico usando un tampón de elución con un pH de 5, a 6, y una conductividad de 1 mS/cm a 1 mS/cm.

14. El método de la reivindicación 13, en el que el anticuerpo es bevacizumab.

15. El método de la reivindicación 13, en el que el tampón de elución comprende NaCl 1 a 3 mM.

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