Protección heteróloga contra pasteurella multocida proporcionada por células de P. multocida fur y sus extractos proteicos de membrana externa.

La invención se refiere a mutantes de Pasteurella multocida capaces de conferir protección heteróloga frente a la infección producida por P.

multocida virulenta. Estos mutantes son defectivos enlos genes fur ompH y fur ompH galE. La presente invención se refiere a composiciones de vacuna contra la bacteria Pasteurella multocida, que comprenden dobles mutantes fur ompH y mutantes triplesfur ompH galE obtenidos a partir de P. multocida, o un extractode proteínas de membrana externa reguladas por hierro (IROMPs) obtenidas a partir de dichos mutantes, y un vehículo y/o adyuvantesfarmacéuticamente aceptables.

Campo de la invención

La invención se refiere a mutantes de Pasteurella multocida capaces de conferir protección heteróloga frente a la infección producida por P. multocida virulenta. Estos mutantes son defectivos en los genes: fur ompH y fur ompH galE. La presente invención se refiere a composiciones de vacuna contra bacterias del género Pasteurella, concretamente Pasteurella multocida que comprenden dobles mutantes fur ompH y mutantes triples fur ompH galE, obtenidos a partir de P. multocida o un extracto de proteínas de membrana externa reguladas por hierro (IROMPs) obtenidas a partir de dichos mutantes y un vehículo y/o adyuvantes farmacéuticamente aceptables.

Estado de la técnica anterior

Las infecciones bacterianas son una causa importante de enfermedades en el mundo, tanto en animales como en el hombre, especialmente en niños. Entre las bacterias causantes de enfermedades se encuentra el género Pasteurella en el que se incluyen en la actualidad 2 especies entre las que se encuentra Pasteurella multocida que es una bacteria patógena que causa diversas enfermedades infecciosas, tales como el cólera aviar, la neumonía bovina, septicemia hemorrágica y rinitis atrófica del cerdo, en animales utilizados para la producción de alimentos, por lo que el control de la enfermedad es de gran importancia para los ganaderos dedicados a la crianza de este ganado.

Por lo tanto es importante desarrollar una vacuna que evite que el ganado se infecte. El objetivo del desarrollo de cualquier vacuna es proporcionar la debida protección durante el mayor tiempo posible.

Tradicionalmente se han desarrollado fundamentalmente tres tipos de vacunas: a) vacunas vivas atenuadas en las que se utiliza el patógeno vivo al que se ha reducido o eliminado su virulencia incapacitado para su crecimiento, b) vacunas en las que se utilizan componentes purificados del patógeno, y c) las vacunas muertas en las que el patógeno muerto se utiliza directamente. Cada uno de estos tipos de vacunas tiene sus ventajas e inconvenientes; las vacunas vivas atenuadas son las que producen una protección en condiciones similares a la de la enfermedad natural. Sin embargo, las vacunas del tipo (b) y (c) son más atractivas desde el punto de vista de la seguridad.

En medicina veterinaria, la vacunación contra P. multocida se basa principalmente en la utilización de células de P. multocida inactivadas, conocidas como bacterinas, o en bacterias vivas atenuadas. Las bacterinas sólo confieren protección homologa; las vacunas vivas proporcionan protección homologa y heteróloga, sin embargo contienen marcadores de atenuación desconocidos y, en algunos casos, han sido asociadas incluso con brotes de epidemias.

En los documentos de patente US 3,855,48, US 4,169,886 y US 4,626,43 se describen vacunas vivas contra P. multocida.

La solicitud de patente WO 98/5691 A2 cuyo título es Uve attenuated vaccines describe bacterias atenuadas en las cuales el gen furo un gen homólogo al mismo, es modificado de manera que la expresión del producto del gen fur, o de su homólogo, es regulada independientemente de la concentración de hierro presente en el medio en que se encuentra la bacteria. Dichas bacterias pueden ser utilizadas como vacunas vivas. El documento se refiere en general a cualquier bacteria gramnegativa aunque se centra en particular en Neisseria meningitidis.

La atenuación de la bacteria se lleva a cabo por mutación de un gen esencial para la producción de un metabolito o catabolito no producido por humanos o animales. Preferiblemente, las mutaciones para atenuar a la bacteria son en el gen aro o en un gen de la ruta de las purinas o pirimidinas. En otro aspecto de la invención, la bacteria comprende una mutación recA.

La invención también proporciona vacunas así como el método para producir una bacteria según la invención y que comprende la modificación del gen fur nativo o de un homólogo, de una bacteria atenuada, de manera que la expresión del gen furo de su homólogo es regulada independientemente de la concentración de hierro presente en el entorno de la bacteria.

El documento señala que, en el pasado, en intentos de producción de vacunas vivas atenuadas, los organismos no producían ciertas proteínas importantes para la protección cruzada durante el cultivo en masa. Estas proteínas incluían las proteínas reguladas por hierro, cuya producción está regulada por el gen fur. Adicionalmente, una vez estas bacterias se administraban al huésped, las cepas de la vacuna no tenían tiempo o recursos metabólicos durante su limitada colonización para expresar estas proteínas.

La producción de cepas de bacterias atenuadas en las cuales la expresión de fur ha sido modificada, es una técnica aplicable de manera general. Así, una bacteria patogénica cuyo genoma comprenda el gen furo un homólogo al mismo, siendo la bacteria atenuada por supresión o modificación de un gen esencial para el crecimiento en el huésped en el que la bacteria es patogénica, puede ser modificada según se ha descrito de manera que la bacteria produce el producto del gen furo de su homólogo de manera independiente a la concentración de hierro presente en el entorno de la bacteria. Los homólogos de fur pueden ser identificados por comparación con secuencias conocidas de otros genes fur como por ejemplo E. coli y N. meningitidis. Preferentemente, estos homólogos son substancialmente homólogos a otros genes fur conocidos, con una identidad de entre 6-7% en una longitud de al menos 1 aminoácidos. Por lo

tanto, genes identificados en otras bacterias que codifican factores de la transcripción y que además presentan la propiedad de responder a la presencia de hierro, también pueden ser usados.

La invención propone también mutaciones en los genes recA y comA para proporcionar estabilidad a la bacteria que se emplea en la vacuna. Estas mutaciones deben ser introducidas como modificaciones genéticas finales, a continuación del resto de modificaciones descritas.

En la solicitud de patente ES 259 53 T3 cuyo título es Vacuna contra la pasteurelosis se describen vacunas contra bacterias del género Pasteurella, y en concreto, en ciertos casos contra Pasteurella multocida.

El documento describe que cuando los organismos de Pasteurella se cultivan bajo condiciones de restricción de hierro, la extracción de la membrana externa o el lisado de la célula entera originan un perfil proteico diferente del obtenido en condiciones normales in vitro, más inmunogénico que el producido por el mismo organismo cultivado bajo condiciones normales de crecimiento. Las células enteras inactivadas de Pasteurella cultivadas bajo condiciones de restricción de hierro que incluye la bacterina, con el propósito de preparar una vacuna, se incluyen dentro de la invención.

La invención propone formular la vacuna para uso de serotipo homólogo, pero también incluye una vacuna polivalente que contiene proteínas reguladas por hierro de todos los serotipos de Pasteurella patológicamente importantes. Así, este documento de solicitud de patente se centra en proteínas reguladas por hierro, anticuerpos monoclonales o policlonales para dichas proteínas y formulaciones de vacunas en las que el material proteico puede estar combinado con cualquiera de los coadyuvantes habituales en vacunas veterinarias. El documento precisa que debe controlarse cuidadosamente las proporciones de agente quelante a utilizar ya que una concentración demasiado grande impediría el cultivo de las bacterias.

En el documento de patente US 6,79,95 B2 cuyo título es Anti-bacterial vaccine compositions se identifican genes virulentos de bacterias gramnegativas (centrándose en Pasteurella multocida como un caso particular) que permite la identificación de nuevos agentes antibacterianos dirigidos contra esos genes virulentos y sus productos.

En esta patente se hace referencia a los intentos para producir composiciones de vacunas, que tradicionalmente utilizan células enteras de bacterias muertas (inactivadas) proporcionando únicamente protección específica de un serotipo, lo cual supone un problema para la vacunación dada la existencia de diferentes serotipos. Los inventores hacen alusión a un estudio en el que una vacuna de bacteria atenuada, que produce una forma inactiva de la toxina Apxll, ha mostrado protección cruzada.

Teniendo en cuenta los problemas asociados con las formulaciones de vacunas que comprenden cepas bacterianas con mutaciones indefinidas, espontáneas, los autores de dicho documento se centran en la construcción de bacterias atenuadas para su uso como vacunas que sean seguras y proporcionen protección homologa y heteróloga contra serotipos de Pasteurella, así como en la identificación de bacterias atenuadas... [Seguir leyendo]

1. Bacteria Pasteurella multocida mutada caracterizada porque es defectiva en los genes fur y ompH de forma tal que no se produce la expresión de fur ni de ompH1 y ompH2.

2. Bacteria Pasteurella multocida de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada porque además de ser defectiva en los genes fur y ompH también lo es en el gen galE de forma tal que se optimiza la superficie de exposición de las proteínas de membrana externa reguladas por hierro de las células de P. multocida fur ompH.

3. Bacteria Pasteurella multocida mutada de acuerdo con las reivindicaciones 1-2, caracterizada por ser defectiva en fur por interrupción del gen salvaje depositado en GenBank con en número de acceso AF27154 versión 1, por integración en el mismo del fragmento interno de 394 pb del gen fur comprendido entre los nucleótidos 18 y 412, amplificado con el cebador Fur1 de secuencia 5-AAACTTTTGAAAAAAGCGC-3y el cebador Fur2 de secuencia 5-CTTGACATTACTACATTTGAA-3.

4. Bacteria Pasteurella multocida mutada, de acuerdo con las reivindicaciones 1-3, caracterizada por ser defectiva en OmpH, presentando una mutación sin sentido en ompH1 en posición 76, y varios cambios nucleotídicos así como una mutación sin sentido en posición 67 en ompH2.

5. Bacteria Pasteurella multocida mutada, de acuerdo con las reivindicaciones 1-4, caracterizada porque la mutación en ompH1 da lugar a un codón stop en lugar de glutamina resultando en una proteína truncada de 24 aminoácidos, y porque la mutación en ompH2 da lugar a una proteína truncada de 223 aminoácidos en lugar de 35 aminoácidos.

6. Bacteria Pasteurella multocida mutada, de acuerdo con las reivindicaciones 1-5, caracterizada por la ausencia de la principal proteína de membrana externa de 36-KDa debido a las mutaciones sin sentido según reivindicaciones 4 y 5.

7. Bacteria Pasteurella multocida mutada, de acuerdo con la reivindicación 2, caracterizada por ser defectiva en galE por interrupción del gen salvaje por integración en el mismo del fragmento interno de galE de 495 pb. obtenido por amplificación con el cebador GalEintup de secuencia 5-GTGTTGCTCAAATCACCGGC-3 y el cebador GalEintrp de secuencia 5-CCACTTGGCTAATATAAGGC-3.

8. Bacteria Pasteurella multocida mutada, de acuerdo con las reivindicaciones 1-7, caracterizada por haber sido inactivada.

9. Bacteria Pasteurella multocida mutada, de acuerdo con la reivindicación 8, caracterizada porque ha sido inactivada térmicamente.

1. Bacteria Pasteurella multocida mutada de acuerdo con la reivindicación 8, caracterizada por haber sido inactivada por sonicación.

11. Utilización del mutante doble Pasteurella multocida fur ompH o mutante triple Pasteurella multocida fur ompH galE de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 1, para obtener una preparación de proteínas de membrana externa.

12. Método para la preparación de una vacuna para la protección heteróloga de animales frente a la infección por P. multocida que se caracteriza porque comprende:

a. la obtención de mutantes de P. multocida defectivos en los genes fur y ompH, o en los genes fur, ompH y galE, de acuerdo con las reivindicaciones 1-1 y/o una preparación de proteínas de membrana externa a la que dichas células de P. multocida mutadas dan lugar, de acuerdo con la reivindicación 11; y

b. la preparación adecuada al método de administración elegido de la vacuna, que comprenda un extracto de células obtenidas en (a) conteniendo una cantidad efectiva del mutante fur ompH o fur ompH galE y/o de proteínas de su membrana externa y un vehículo y/o adyuvantes farmacéuticamente aceptables.

13. Método para la preparación de una vacuna para la protección heteróloga de animales frente a la infección por P. multocida, de acuerdo con la reivindicación 12, que se caracteriza porque las células del mutante doble fur ompH o del mutante triple fur ompH galE han sido inactivadas térmicamente.

14. Método para la preparación de una vacuna para la protección heteróloga de animales frente a infección por P. multocida, de acuerdo con la reivindicación 12, que se caracteriza porque las células del mutante fur, del mutante doble fur ompH o del mutante triple fur ompH galE han sido inactivadas por sonicación.

15. Composición de vacuna para la protección heteróloga de animales contra la infección por Pasteurella multocida caracterizada porque comprende una cantidad inmunogénica del mutante doble fur ompH o del mutante triple fur ompH gal E de acuerdo con las reivindicaciones 12-14, un vehículo y/o adyuvantes farmacéuticamente aceptables.

16. Composición de vacuna de acuerdo con la reivindicación 15, para proteger de forma heteróloga a animales de enfermedades causadas por infección por P. multocida, tales como neumonías en ganado porcino y vacuno, cólera aviar y neumonías en mamíferos pequeños como conejos y hamsters.

17. Utilización del mutante doble Pasteurella multocida fur ompH o del mutante triple Pasteurella multocida fur ompH galE para la preparación de una vacuna para la protección heteróloga de animales contra la infección por Pasteurella multocida de acuerdo con las reivindicaciones 12-16.

18. Utilización del muíante doble Pasteurella multocida fur ompH para la preparación de una vacuna para la protección heteróloga de animales contra la infección por Pasteurella multocida de acuerdo con las reivindicaciones 12-16.

19. Utilización del muíante triple Pasteurella multocida fur ompH galE para la preparación de una vacuna para la protección heteróloga de animales contra la infección por Pasteurella multocida de acuerdo con las reivindicaciones 12-16.