Producción y utilización de bancos de genes de anticuerpos humanos ("bibliotecas de anticuerpos humanos").

LA INVENCION CONCIERNE A LA PRODUCCION Y APLICACION DE BANCOS DE GENES DE ANTICUERPOS HUMANOS (AK).

PARTIENDO DE UNA MEZCLA DE LINFOCITOS-B HUMANOS, SU MRNA SE TRADUCIRA CON LA APLICACION DE OLIGOPRIMERES-DT EN CDNA. A CONTINUACION TIENE LUGAR UNA AMPLIFICACION DE LOS AK-ESPECIFICOS CDNA MEDIANTE LA REACCION DE CADENAS DE POLIMERASO (PCR, POLYMERASE CHAIN REACTION) BAJO LA APLICACION DE LAS CONVENIENTES SECUENCIAS PRIMER DE OLIGONUCLEOTIDAS. MEDIANTE LA EXPRESION DE ESTOS AK-ESPECIFICOS CDNA AMPLIFICADOS EN UN VECTOR DE EXPRESION BACTERIANO, COMO POR EJEMPLO EN SIGUIENTE VECTOR PFMT DESCRITO, EN E.COLI, ESTA ASI UNA BIBLIOTECA DE ANTICUERPOS HUMANOS CON UN EXTENSO REPERTORIO A DISPOSICION PARA EL EXAMEN (SCREENEN) CON ANTIGENOS SELECCIONADOS IN VITRO.

Producción y utilización de bancos de genes de anticuerpos humanos (bibliotecas de anticuerpos humanos) .

El invento se refiere a la producción y la utilización de bancos de genes de anticuerpos (AK) humanos. Partiendo de una mezcla de linfocitos B humanos, su ARNm (ácido ribonucleico mensajero) se traduce en un ADNc (ácido desoxirribo-nucleico complementario) mediando utilización de cebadores oligo-DT. A continuación, tiene lugar una amplificación del ADNc específico para AK mediante una reacción en cadena de la polimerasa (PCR, de Polymerase Chain Reaction) mediando empleo de apropiadas secuencias de cebadores oligonucleótidos. Mediante expresión de este ADNc amplificado, específico para AK, en un vector bacteriano de expresión, p.ej. el vector pFMT descrito seguidamente, en el seno de E. coli, está a disposición por consiguiente una biblioteca de anticuerpos humanos con un repertorio amplio para el escrutinio (de screening) in vitro con antígenos seleccionados.

Se estima que el sistema inmunitario de un ser humano o de un animal mamífero posee entre 10⁶ y 10⁸ diferentes anticuerpos. Este número de anticuerpos es suficiente como para provocar una reacción inmunitaria del cuerpo, tanto contra la totalidad de los antígenos presentes en la naturaleza, como también contra antígenos artificiales. Si además se toma en consideración el hecho de que, con frecuencia, varios anticuerpos reaccionan con el mismo antígeno, el repertorio de anticuerpos realmente diferentes ha de establecerse más bien en el intervalo de 10⁶ a 10⁷.

Hasta ahora, se obtenían anticuerpos específicos siempre partiendo de una inmunización con el respectivo antígeno, por ejemplo de una inyección del antígeno en el organismo o una incubación de células de bazo (esplenocitos) in vitro con este antígeno. En el caso de anticuerpos policlonales, se pueden aislar a continuación las inmunoglobulinas a partir del suero, y se pueden obtener a partir de ellas los anticuerpos específicos, p.ej. por procedimientos de absorción. Los anticuerpos monoclonales se aíslan a partir de los materiales sobrenadantes celulares o a partir del material lisado de células de tumor de bazo (células de hibridoma) clonadas, que están fusionadas con linfocitos B individuales. Los procedimientos antes expuestos no son apropiados en particular para la producción de anticuerpos humanos específicos o de anticuerpos monoclonales humanos.

El presente invento se estableció, por lo tanto, la misión de desarrollar un método realizable de un modo general para la producción de anticuerpos monoclonales humanos específicos (huMAK's) o de partes de anticuerpos, que contienen el sitio de fijación a antígenos.

Se encontró que los huMAK's buscados, o sus partes, que contienen el dominio variable que se fija a un antígeno, se pueden aislar a partir de bancos de genes de inmunoglobulinas humanas. En primer término, partiendo una mezcla de linfocitos B humanos no activados, se aisló el ARNm de éstos y, con ayuda de cebadores oligo-dT, se tradujo en un ADNc. Una amplificación específica de la población de los ADNc's de anticuerpos dentro de la agrupación obtenida de ADNc's, se consiguió mediante la utilización de la PCR. Para esto, se utilizaron determinados cebadores oligonucleótidos, que son homólogos con respecto a secuencias conservadas en ambos extremos del ADNc de anticuerpos (véanse más adelante y los Ejemplos) . La concepción de los cebadores para la reacción hacia atrás, con el fin de realizar la síntesis de la cadena no codificadora del ADN de la cadena pesada, se basa en secuencias de IgM (subclase III, puesto que ésta abarca la mayor parte de las secuencias de IgM) . Las moléculas de IgM están representadas en linfocitos B no activados con mayor frecuencia que todas las otras clases de inmunoglobulinas. Por el contrario, las secuencias de IgG predominan en linfocitos B activados, cuyo repertorio de diferentes anticuerpos es muchísimo más pequeño. En el caso de una biblioteca de IgG podría existir además de ello el peligro de que una IgG o unas pocas IgG's, expresadas de manera especialmente intensa, dominasen en la biblioteca.

Hasta 30 rondas de amplificación se llevaron a cabo de una manera conveniente. Los cebadores (primer) oligonucleótidos contienen apropiados sitios de restricción, con el fin de insertar el ADN amplificado, p.ej. en el plásmido de expresión de anticuerpos pFMT (véase más adelante) . Este plásmido de expresión hace posible la expresión de un ADNc de anticuerpo y la subsiguiente segregación de los productos de expresión en bacterias (E. coli) . El operón de anticuerpo del plásmido contiene las secuencias de la parte variable tanto de la cadena pesada como también de la cadena ligera de un anticuerpo. Secuencias de guía (leader) apropiadas, procedentes del extremo terminal de amino de una proteína bacteriana, hacen posible la segregación de las partes de anticuerpos. Las secuencias de guía son separadas al realizar la secreción de una enzima bacteriana. Durante la secreción de los productos del ADNc de anticuerpo, se asocian las cadenas ligera y pesada del anticuerpo (con o sin un dominio constante colindante) . De este modo se forma un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo, que contiene un sitio funcional de fijación a un antígeno. Estructuras artificiales (construcciones) similares para anticuerpos individuales han sido descritas también por otros autores (Better y colaboradores (1988) , Science 240, 1041, y Skerras & Plückthun (1988) , Science 240, 1038) .

La amplificación de ADN's, que codifican las partes variables de anticuerpos, se describió ciertamente por otros autores (Orlandi y colaboradores (1989) , Proc. Natl. Acad. Sci. 86, 3833; Sastr y y colaboradores, (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. 86, 5728; Ward y colaboradores (1989) , Nature 341, 544) ; Huse y colaboradores (1989) , Science 246, 275) . En este caso, sin embargo, el ARNm procedente de células de hibridoma o de linfocitos de bazo, que entre otras cosas codifica también anticuerpos, se aisló después del tratamiento con un antígeno determinado. Por lo tanto, allí se emplearon también secuencias de cebadores, que se basan solamente en secuencias de IgG. Esto naturalmente presenta ventajas allí donde se busca el mayor número que sea posible de clones de ADN de anticuerpos, que proceden de linfocitos activados. Con cebadores procedentes de secuencias de IgG, son muchísimo mayores las posibilidades de encontrar clones que contengan los ADN que codifiquen anticuerpos contra el antígeno inyectado. Hay que añadir a esto el hecho de que en los precedentes trabajos se sintetizaron ADN de anticuerpos murinos, y por lo tanto, por consiguiente, no humanos, y adicionalmente se amplificaba mediando exclusión de zonas de la cadena lambda.

En el presente invento pasan a emplearse por el contrario secuencias de cebadores, que son homólogas con respecto a secuencias existentes en los dominios constantes de ADNc de IgM. Así, el invento se puede realizar de un modo óptimo, es decir que se puede poner a disposición una multiplicidad muy grande de anticuerpos, a saber el repertorio total de anticuerpos, en forma de una biblioteca. La expresión, preferiblemente, en E. coli proporciona entonces la buscada biblioteca de anticuerpos humanos, en la que los anticuerpos humanos, o las partes de tales anticuerpos, que se buscaban, se encuentran por escrutinio de clones bacterianos con el antígeno elegido.

En la Tabla 1 se recopilan apropiados cebadores oligonucleótidos para la amplificación. Las posiciones de los cebadores antes mencionados en las cadenas μ, kappa y lambda se representan esquemáticamente en la Tabla 2. Las construcciones biológicas moleculares en particular, y entre ellas también el vector de expresión, es decir el plásmido de expresión de anticuerpos, pFMT, se describen en los siguientes Ejemplos.

El invento se refiere, como consecuencia de ello, a bibliotecas de anticuerpos humanos, que se producen por medio de una transcripción del ARNm procedente de linfocitos B humanos (periféricos) no activados, mediante cebadores oligo-dT, de una subsiguiente amplificación por una PCR mediando utilización de cebadores que contienen secuencias que son homólogas con respecto a zonas conservadas de un ADNc de IgM, y de una subsiguiente incorporación en apropiados plásmidos de expresión con el fin de realizar la expresión en microorganismos, de modo preferido en el vector de expresión pFMT para la expresión en E. coli. En una forma preferida de realización, se incorpora adicionalmente una secuencia, que codifica un péptido marcador, p.ej. una secuencia TAG,... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para la producción de bibliotecas de anticuerpos humanos, caracterizado porque se aísla un ARNm a partir de linfocitos B humanos periféricos no activados y se transcribe en un ADNc, a continuación el ADNc que codifica los anticuerpos se amplifica por una PCR mediante cebadores apropiados, a continuación de ello se lleva a cabo una incorporación en apropiados plásmidos de expresión, y finalmente se efectúa una expresión del ADNc de anticuerpos en clones individuales, y porque mediante los cebadores utilizados se amplifican en cada caso solamente las regiones variables, que no codifican plásmidos de expresión para ningún dominio constante de un anticuerpo y porque la concepción de los cebadores utilizados para la reacción hacia atrás, con el fin de sintetizar la cadena no codificadora de la cadena pesada, se basa en secuencias de IgM.

2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque la expresión se efectúa en el plásmido pFMT de acuerdo con la Tabla 6.

3. Procedimiento para el aislamiento de anticuerpos humanos específicos caracterizado porque con antígenos específicos se escrutan bibliotecas de anticuerpos humanos producidas de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2.