Procedimiento de producción de beta-santaleno.

Un procedimiento de producción de ß-santaleno que comprende

a) poner en contacto FPP con al menos un polipéptido con una actividad ß-santaleno sintasa y que comprende una secuencia de aminoácidos idéntica a SEC ID N.

º: 1 o 3;

b) opcionalmente, aislar el ß-santaleno producido en la etapa a).

Procedimiento de producción de beta-santaleno

Campo técnico

La presente invención proporciona un procedimiento de producción de ß-santaleno, comprendiendo dicho procedimiento poner en contacto al menos un polipéptido con pirofosfato de farnesilo (FPP) . En particular, dicho procedimiento se puede llevar a cabo in vitro o in vivo para producir ß-santaleno, un compuesto muy útil en los campos de la perfumería y la aromatización. La presente invención también proporciona la secuencia de aminoácidos de un polipéptido útil en el procedimiento de la invención. Un ácido nucleico que codifica el polipéptido de la invención y un vector de expresión que contiene dicho ácido nucleico son también parte de la presente invención. Un organismo huésped no humano de una célula transformada para usarse en el procedimiento de producción de ß-santaleno es también un objeto de la presente invención. El polipéptido de la invención comprende una secuencia aminoacídica idéntica a SEC ID N.º: 1 o 3 y el ácido nucleico de la invención codifica dicho polipéptido.

Técnica anterior

Se encuentran terpenos en la mayoría de los organismos (microorganismos, animales y plantas) . Estos compuestos están compuestos de cinco unidades de carbono llamadas unidades de isopreno y se clasifican por el número de estas unidades presentes en su estructura. Así, los monoterpenos, los sesquiterpenos y los diterpenos son terpenos que contienen 10, 15 y 20 átomos de carbono respectivamente. Los sesquiterpenos, por ejemplo, se encuentran ampliamente en el reino vegetal. Muchas moléculas de sesquiterpenos se conocen por sus propiedades de aroma y fragancia y sus efectos cosméticos, medicinales y antimicrobianos. Se han identificado por encima de 300 hidrocarburos sesquiterpenos y por encima de 3000 sesquiterpenoides (Joulain, D. y König, W.A., The Atlas of Spectral Data of Sesquiterpene Hydrocarbons, EB Verlag, Hamburgo, 1998; Connolly, J.D., Hill R.A., Dictionar y of Terpenoids, vol. 1, Chapman and Hall (editor) , 1991) y se identifican cada año muchas estructuras nuevas. Los extractos vegetales obtenidos por medios diferentes tales como destilación de vapor o extracción de disolventes se usan como fuente de terpenos. Las moléculas de terpenos se usan a menudo como tales, pero en algunos casos las reacciones químicas se usan para transformar los terpenos en otras moléculas de valor alto.

La producción biosintética de terpenos implica enzimas llamadas terpeno sintasas. Hay virtualmente una infinidad de sesquiterpeno sintasas presentes en el reino vegetal, usando todas el mismo sustrato (pirofosfato de farnesilo, FPP) pero que tienen perfiles de producto diferentes. Los genes y ADNc que codifican sintasas de sesquiterpenos se han clonado y sus las enzimas recombinantes correspondientes se han caracterizado. La biosíntesis de terpenos en plantas y otros organismos se ha estudiado exhaustivamente y no se detalla adicionalmente aquí, pero se hace referencia a Dewick, Nat. Prod. Rep., 2002, 19, 181-222, que revisa el estado de la técnica de las rutas de biosíntesis de terpenos.

ß-santaleno es una molécula de sesquiterpeno que se da en la naturaleza que se puede usar como material de partida para la síntesis química o para la biosíntesis de ß-santalol (como se representa en la figura 2B) , que es un constituyente principal de aceite de sándalo. El aceite de sándalo es un ingrediente de perfumería importante que se obtiene por destilación del duramen de las especies de Santalum. El sándalo se usa también grandemente para inciensos y medicina tradicional. El aceite contiene 90 % de alcoholes de sesquiterpenos. Entre los diferentes isómeros de santalol, ß-santalol es el principal contribuyente para el típico olor dulce-leñoso y balsámico de aceite de sándalo. Otros constituyentes tales como epi-ß-santalol y a-santalol pueden contribuir también a la nota de sándalo.

En general, el precio y la disponibilidad de los extractos naturales de plantas son dependientes de la abundancia, producción de aceite y origen geográfico de las plantas. Además, la disponibilidad y calidad de los extractos naturales es muy mucho dependiente del clima y de otras condiciones locales que conducen a variabilidad de año en año, volviendo el uso de tales ingredientes en perfumería de alta calidad muy difícil o incluso imposible algunos años. Debido a la sobreexplotación de los recursos naturales, las dificultades de cultivo, el crecimiento lento de las plantas de Santalum, las disponibilidades de materia prima de sándalo han disminuido radicalmente durante las pasadas décadas. Por lo tanto, sería una ventaja proporcionar una fuente de ß-santalol, que esté menos sujeta a fluctuaciones en disponibilidad y calidad. Una síntesis química de los constituyentes sesquiterpenos de sándalo hasta el momento no está disponible. Una ruta bioquímica que conduce a la síntesis de ß-santaleno, que podría usarse después para producir ß-santalol, sería por lo tanto de gran interés.

El santaleno tipo sesquiterpeno y particularmente sesquiterpenos con el esqueleto de ß-santaleno, se identificaron en varias especies de plantas. Empero, no se ha descrito aún ninguna sesquiterpeno sintasa capaz de producir ß-santaleno.

Una sesquiterpeno sintasa capaz de sintetizar al menos un sesquiterpeno bicíclico y/o tricíclico que tiene un esqueleto de carbono de santaleno, el ácido nucleico correspondiente y un procedimiento de producción tal compuesto que tiene un esqueleto de carbono de santaleno se divulga en la solicitud de patente internacional WO 2006/134523. No obstante, no se detectó ninguna traza de ß-santaleno como producto de las sesquiterpeno sintasas divulgadas en los ejemplos. El único producto con un esqueleto de santaleno fue epi-beta-santaleno. Las propiedades de epi-beta-santaleno son muy diferentes de aquellas de ß-santaleno. En particular, no es de interés la síntesis de ß-santalol. Además, la sesquiterpeno sintasa divulgada en el documento WO 2006/134523 comparte solo el 27 % de identidad con la secuencia de la invención.

El porcentaje de identidad entre sintasas de sesquiterpenos conocido a partir de las bases de datos y los polipéptidos de la invención es muy bajo. La secuencia de proteínas más cercana a la ß-santaleno sintasa de la invención es una monoterpeno sintasa de Santalum album (n.º de acceso ACF24767; Jones, C.G., Keeling, C.I., Ghisalberti, E.L., Barbour, E.L., Plummer, J.A. y Bohlmann, J. Arch. Biochem. Biophys., 2008, 477 (1) , 121-130) que comparte identidad de secuencia de aminoácidos del 58 % con la ß-santaleno sintasa de la invención. Cuando se puso en contacto con FPP, esta enzima produce por encima del 90 % de ß-bisaboleno y no se forma ningún isómero de santaleno. Un documento publicado de forma reciente, WO 2011/000026 (6 de enero de 2011) , divulga secuencias de santaleno sintasa muy similares.

Además de las diferencias entre las propias secuencias, también ha de indicarse que la estructura y las propiedades de los productos sintetizados por la enzima mencionada anteriormente son muy diferentes de aquellas del sesquiterpeno ß-santaleno. En particular, los monoterpenos producidos por esta enzima, es decir alfa-terpineol, limoneno, geraniol, mirceno, linalool y algunos otros productos secundarios no son adecuados como un material de partida para la síntesis de ß-santalol, que es un ingrediente muy útil en el campo de la perfumería.

A pesar de estudios exhaustivos de ciclación de terpenos, el aislamiento y la caracterización de las terpeno sintasas aún es difícil, en particular en plantas, debido a su baja abundancia, sus patrones de expresión a menudo transitorios y la complejidad de purificarlos a partir de las mezclas de resinas y de los compuestos fenólicos en tejidos donde se expresan.

Es un objetivo de la presente invención proporcionar procedimientos para fabricar ß-santaleno en una ruta económica, como se indica anteriormente. De acuerdo con ello, la presente invención tiene el objetivo de producir ß-santaleno teniendo mientras pocos desechos, un procedimiento más eficiente en lo que respecta a energía y recursos y que reduzca mientras la dependencia de los combustibles fósiles, Es un objetivo adicional proporcionar enzimas capaces de sintetizar ß-santaleno, que es útil como ingrediente de perfumería y/o de aromas.

Abreviaturas usadas

ACC ácido 1-aminociclopropanocarboxílico

pb par de bases

kb kilobase

BSA seroalbúmina bovina

2, 4D ácido 2, 4-diclorofenoxiacético

ADN ácido desoxirribonucleico

ADNc ADN complementario

dNTP desoxinucleotido trifosfato

DTT ditiotreitol

EDTA ácido etilendiaminatetraacético

FPP pirofosfato de farnesilo

CG cromatografía de... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento de producción de ß-santaleno que comprende

a) poner en contacto FPP con al menos un polipéptido con una actividad ß-santaleno sintasa y que comprende una secuencia de aminoácidos idéntica a SEC ID N.º: 1 o 3; b) opcionalmente, aislar el ß-santaleno producido en la etapa a) .

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la etapa a) comprende cultivar un organismo huésped no humano o célula capaz de producir FPP y transformada para expresar al menos un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos idéntica a SEC ID N.º: 1 o 3 y que tiene una actividad ß-santaleno sintasa, según condiciones que conducen a la producción de ß-santaleno.

3. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que el procedimiento comprende adicionalmente, antes de la etapa a) , transformar un organismo huésped no humano o una célula huésped no humana capaz de producir FPP con al menos un ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos idéntica a la SEC ID N.º: 1 o 3 y que tiene una actividad ß-santaleno sintasa, tal que dicho organismo expresa dicho polipéptido.

4. El procedimiento de la reivindicación 3, en el que el al menos un ácido nucleico que codifica la ß-santaleno sintasa, comprende una secuencia de nucleótidos idéntica a la SEC ID N.º: 2, 4 o al complemento de la misma.

5. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en el que el organismo huésped no humano es una planta, una procariota o un hongo.

6. El procedimiento de la reivindicación 5, en el que el organismo huésped no humano es un microorganismo.

7. El procedimiento de la reivindicación 6, en el que el microorganismo es una bacteria o levadura.

8. El procedimiento de la reivindicación 7, en el que dicha bacteria es E. coli y dicha levadura es Saccharomyces cerevisiae.

9. Un polipéptido que tiene una actividad ß-santaleno sintasa y que comprende una secuencia de aminoácidos idéntica a la SEC ID N.º: 1 o 3.

10. El polipéptido de la reivindicación 9, que consiste en una secuencia de aminoácidos idéntica a SEC ID N.º: 1 o 3.

11. Un ácido nucleico que codifica un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 9 o 10.

12. El ácido nucleico de la reivindicación 11, que comprende una secuencia de nucleótidos idéntica a SEC ID N.º: 2, 4

o al complemento de la misma.

13. El ácido nucleico de la reivindicación 12, que consiste en una secuencia de nucleótidos idéntica a SEC ID N.º: 2, 4

o al complemento de la misma.

14. Un vector de expresión que comprende el ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13.

15. Un organismo o célula huésped no humano transformado para albergar al menos un ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, de tal forma que exprese o sobreexprese heterólogamente al menos un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 9 o 10.

16. El organismo huésped no humano de la reivindicación 15, en el que dicho organismo huésped no humano es una planta, un procariota o un hongo.

17. El organismo huésped no humano de la reivindicación 16, en el que dicho organismo huésped no humano es un microorganismo.

18. El organismo huésped no humano de la reivindicación 17, en el que dicho microorganismo es una bacteria o levadura.

19. El organismo huésped no humano de la reivindicación 18, en el que dicha bacteria es E. coli y dicha levadura es Saccharomyces cerevisiae.

20. Un procedimiento de producción de al menos un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 19 que comprende

a) cultivar un organismo o célula huésped no humano transformado con el vector de expresión de la reivindicación 14, tal que ello alberge un ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13 y exprese o sobreexprese un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 9 o 10;

b) aislar el polipéptido del organismo huésped no humano o de la célula huésped no humana cultivado en la etapa a) .

21. El procedimiento de la reivindicación 20, que comprende adicionalmente, antes de la etapa a) , transformar un organismo o célula huésped no humano con el vector de expresión de la reivindicación 14, tal que ello alberge un ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13 y exprese o sobreexprese el polipéptido de la reivindicación 9 o 10.

22. Un procedimiento de preparación de un polipéptido variante que tiene una actividad ß-santaleno sintasa que comprende las etapas de:

(a) seleccionar un ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13;

(b) modificar el ácido nucleico seleccionado para obtener al menos un ácido nucleico mutante;

(c) transformar células huéspedes u organismos unicelulares huéspedes con la secuencia de ácidos nucleicos mutante para expresar un polipéptido codificado por la secuencia de ácidos nucleicos mutante;

(d) rastrear el polipéptido por al menos una propiedad modificada; y

(e) opcionalmente, si el polipéptido no tiene ninguna actividad ß-santaleno sintasa variante deseada,

repetir las etapas del procedimiento (a) a (d) hasta que se obtiene un polipéptido con una actividad 15 ß-santaleno sintasa variante deseada;

(f) opcionalmente, si un polipéptido que tiene una actividad ß-santaleno sintasa variante deseada se identificó en la etapa (d) , aislar el ácido nucleico mutante correspondiente obtenido en la etapa (c) .

Figura 1, parte 2 Figura 1, parte 3 Figura 1, parte 4

Beta Santaleno Figura 2A

Figura 2B