Procedimientos y agentes para el diagnóstico y el tratamiento de carcinoma hepatocelular.

Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a la SEC ID Nº 23 con una Kd de 10-7 M o menor medida usando una microbalanza de cristal de cuarzo ANTQ300,

para su uso en un procedimiento in vivo para detectar carcinoma hepatocelular (HCC) en un sujeto, que comprende administrar el anticuerpo por inyección intra-arterial o inyección intravenosa, en el que el anticuerpo comprende un radioisótopo, obtener una imagen del hígado de un sujeto y detectar la acumulación del anticuerpo en el hígado de un sujeto en el que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende

a) un dominio variable de anticuerpo que comprende una CDR1 que consiste en la SEC ID Nº 5, una CDR2 que consiste en la SEC ID Nº 6, y una CDR3 que consiste en la SEC ID Nº 7; y un dominio variable de anticuerpo que comprende una CDR1 que consiste en la SEC ID Nº 10, una CDR2 que consiste en la SEC ID Nº 11, y una CDR3 que consiste en la SEC ID Nº 12; o

b) un dominio variable de anticuerpo que comprende una CDR1 que consiste en la SEC ID Nº 15, una CDR2 que consiste en la SEC ID Nº 16, y una CDR3 que consiste en la SEC ID Nº 17 y un dominio variable de anticuerpo que comprende una CDR1 que consiste en la SEC ID Nº 20, una CDR2 que consiste en la SEC ID Nº 21, y una CDR3 que consiste en la SEC ID Nº 22.

Procedimientos y agentes para el diagnóstico y el tratamiento de carcinoma hepatocelular Antecedentes de la invención

El carcinoma hepatocelular (HCC) es el tumor maligno primario más frecuente del hígado y es el quinto cáncer más común en los seres humanos en todo el mundo. El HCC también es la cuarta causa principal de muerte relacionada con cáncer (Parkin DM, Bray F, Ferlay J, Pisani P. Estimating the world cáncer burden: Globocan 2. Int J Cáncer 21;94:153-156). En 199, la Organización Mundial de la Salud estimó que había aproximadamente 43. nuevos casos de cáncer de hígado en todo el mundo, y que un número similar de pacientes murió ese año como consecuencia de esta enfermedad.

La patogénesis de HCC se ha asociado con infecciones por el virus de la hepatitis crónica B (VHB) y el virus de la hepatitis C (VHC), así como afecciones inducidas por cirrosis del hígado (Bruix J, y col. J Hepatol. 35: 421-43, 21; Bruix J, y col. Cáncer Cell 5: 215-219, 24). Por consiguiente, la incidencia de HCC es más alta en los países del este de Asia, como China, Hong Kong, Taiwán, Corea y Japón, donde las infecciones por VHB y el VHC son más frecuentes (Bruix J, y col. Cáncer Cell. 5: 215-219, 24; Haskell CM. Capítulo 46 Hígado: Historia Natural, Diagnóstico y Estadificación en "Cáncer Treatment" 5a edición, W. B, Saunders Company, Philadelphia, editores: Haskell CM y Berek JS). Sin embargo, la incidencia de HCC en los países occidentales es cada vez mayor (Parkin DM, y col. Int J Cáncer 94; 153-156, 21). Durante la última década en los Estados Unidos, el HCC presentó el segundo mayor aumento en la incidencia, y el mayor aumento en la tasa de mortalidad, de todos los cánceres (Ann Int Med 139: 817-823, 23). Por tanto, en los Estados Unidos y en todo el mundo, el HCC es una causa importante de mortalidad y morbilidad, y una importante carga económica debido a los costes de hospital y la pérdida de trabajo por personas con HCC.

El control exitoso de HCC requiere un diagnóstico correcto de la enfermedad en una fase temprana de progresión de la enfermedad. Sin embargo, distinguir los pequeños tumores de HCC de otras enfermedades hepáticas malignas o no malignas, incluyendo tumores metastásicos, colangiocarcinoma, hiperplasia nodular focal, nodulos hepáticos displásicos y regeneradores, usando las técnicas actuales, tales como estudios de imagen, biopsia con aguja gruesa y/o aspiración con aguja fina, ha demostrado ser un reto (Ferrell LD, y col. Am J Surg Pathol 17: 1113-1123, 1993; Horigome H, y col. Hepato-Gatroenterology 47: 1659-1662, 2; Kalar S, y col. Arch Pathol. Lab Med 131: 1648- 1654, 27; Seki S, y col. Clin Cáncer Res 6: 346-3473, 2). Además, los intentos por tratar terapéuticamente HCC han tenido muy poco éxito (Bruix J, y col. J Hepatol 35: 421-43, 21; Bruix J, y col. Cáncer Cell. 5: 215-219, 24; Haskell CM Capítulo 46 Hígado: Historia Natural, Diagnóstico y Estadificación en "Cáncer Treatment" 5a edición, W. B, Saunders Company, Philadelphia, editores: Haskell CM y Berek JS; Szklaruk J, y col. AJR 18: 441- 453, 23). Como resultado, a pesar de la terapia activa, la tasa de supervivencia a 5 años de pacientes con HCC en los Estados Unidos es sólo del 1,5%, que es la segunda en magnitud sólo para cáncer de páncreas (ACS Cáncer Facts & Figures (27)). Por tanto, existe una necesidad urgente de identificar un marcador más fiable para diferenciar HCC de otras patologías hepáticas y facilitar la detección precoz de esta enfermedad. Además, existe una necesidad urgente de desarrollar agentes terapéuticos nuevos y más eficaces para el tratamiento de HCC.

El documento WO 3/24392 desvela que la vasculatura asociada al tumor en carcinomas hepatocelulares era fuertemente positiva para hibridación in situ de TAT215, correspondiente a la presente SEC ID N° 23.

Sumario de la invención

La materia objeto de la invención se define en las reivindicaciones adjuntas.

La invención se refiere a un procedimiento para diagnosticar un carcinoma hepatocelular (HCC) en un sujeto (por ejemplo, un ser humano), que comprende detectar el nivel de proteína PLVAP en una muestra del sujeto y determinar que el nivel de la proteína PLVAP en la muestra está aumentado respecto a un control. De acuerdo con la invención, un nivel aumentado de la proteína PLVAP en la muestra respecto al control es indicativo de la presencia de HCC en el sujeto. Se usa un anticuerpo que se une específicamente a PLVAP para detectar el nivel de una proteína PLVAP en una muestra del sujeto.

En otra realización más, la invención se refiere a un procedimiento in vivo para detectar HCC en un sujeto (por ejemplo, un ser humano), que comprende administrar un anticuerpo marcado con radioisótopo que se une específicamente a PLVAP por inyección intra-arterial o intravenosa, obtener una imagen del hígado del sujeto y detectar la acumulación del anticuerpo en el hígado del sujeto. De acuerdo con la invención, la detección de la acumulación del anticuerpo en el hígado es indicativa de HCC en el sujeto.

Breve descripción de los dibujos

La FIG. 1 es un diagrama de flujo que representa un algoritmo para la identificación de genes que muestran expresión diferencial extrema entre tejidos tumorales y tejidos no tumorales adyacentes.

La FIG. 2 es un gráfico que representa intensidades de expresión de genes PLVAP en muestras de tejido hepático HCC (PHCC) y no tumoral adyacente (PN) emparejadas (n = 18), así como muestras de HCC no

emparejadas (n = 82) determinadas por perfilado de transcritos de ARNm usando chips génicos Affymetrix.

La FIG. 3A es un gráfico que representa las cantidades relativas de expresión de PLVAP en muestras de tejido hepático HCC (PHCC) y no tumoral adyacente (PN) emparejadas determinadas por RT-PCR cuantitativa Taqman. Los niveles de ARNm de PLVAP son significativamente superiores en tejidos hepáticos HCC respecto a no tumorales.

La FIG. 3B es un gráfico que representa las intensidades de expresión de genes PLVAP en 18 muestras de tejido hepático HCC (PHCC) y no tumoral adyacente (PN) emparejadas determinadas por análisis de microseries. Los niveles de transcrito de PLVAP fueron mayores en tejido hepático HCC que en el no tumoral adyacente de cada individuo para todos los individuos estudiados, excepto uno.

Las FIG. 4A y 4B muestran la secuencia de nucleótidos (SEC ID N° 1) y la secuencia de aminoácidos deducida (SEC ID N° 2) de la proteína de fusión recombinante PLVAP51.442 humana marcada con His usada para generar antisueros policlonales de ratón anti-PLVAP.

La FIG. 5 es una imagen de una transferencia de Western que representa la detección de la proteína PLVAP recombinante antes y después de digestión con trombina para eliminar la marca His. Las flechas a la izquierda de la transferencia indican las posiciones de His-PLVAP y PLVAP en la transferencia. Los números a la izquierda de la transferencia indican las posiciones de patrones de peso molecular.

La FIG. 6A es un gráfico que representa la presencia de cantidades relativas significativas de ARNm de PLVAP en células endoteliales HCC obtenidas por microdisección de captura láser de dos muestras de tejido HCC (muestra A (negro) y muestra B (gris)) determinadas por RT-PCR cuantitativa en tiempo real de dos etapas. Las líneas discontinuas representan señales de RT-PCR cuantitativa Taqman de ARNm de beta-actina en las mismas muestras usadas para RT-PCR cuantitativa de ARNm de PLVAP. Los resultados indican la presencia de ARNm de PLVAP fácilmente medible en las células endoteliales diseccionadas (líneas continuas).

La FIG. 6B es un gráfico que representa la ausencia de cantidades relativas significativas de ARNm de PLVAP en células obtenidas por microdisección de captura láser de tejido hepático no tumoral adyacente a tejido HCC en dos muestras de HCC (muestra A (negro) y muestra B (gris)) determinadas por RT-PCR cuantitativa en tiempo real Taqman de dos etapas. Los resultados indican que no hay ARNm de PLVAP detectable (línea continua negra) y apenas detectable (línea gris continua) en las células diseccionadas.

La FIG. 6C es un gráfico que representa las cantidades relativas de ARNm de PLVAP en células tumorales HCC obtenidas por microdisección de captura láser de dos muestras de tejido HCC (muestra A (negro) y muestra B (gris)) determinadas por RT-PCR cuantitativa en tiempo real Taqman de dos etapas. Los resultados indican la presencia de cantidades muy pequeñas de ARNm de PLVAP (líneas continuas) en las células HCC diseccionadas debido a la inevitable contaminación minoritaria de la parte de células endoteliales vasculares unidas a las células HCC diseccionadas.

La FIG. 7 es un gráfico que representa el título de anticuerpos... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a la SEC ID N° 23 con una Kd de 1'7 M o menor medida usando una microbalanza de cristal de cuarzo ANTQ3, para su uso en un procedimiento in vivo para detectar carcinoma hepatocelular (HCC) en un sujeto, que comprende administrar el anticuerpo por inyección intra-arterial o inyección intravenosa, en el que el anticuerpo comprende un radioisótopo, obtener una imagen del hígado de un sujeto y detectar la acumulación del anticuerpo en el hígado de un sujeto en el que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende

a) un dominio variable de anticuerpo que comprende una CDR1 que consiste en la SEC ID N° 5, una CDR2 que consiste en la SEC ID N° 6, y una CDR3 que consiste en la SEC ID N° 7; y un dominio variable de anticuerpo que comprende una CDR1 que consiste en la SEC ID N° 1, una CDR2 que consiste en la SEC ID N° 11, y una CDR3 que consiste en la SEC ID N° 12; o

b) un dominio variable de anticuerpo que comprende una CDR1 que consiste en la SEC ID N° 15, una CDR2 que consiste en la SEC ID N° 16, y una CDR3 que consiste en la SEC ID N° 17 y un dominio variable de anticuerpo que comprende una CDR1 que consiste en la SEC ID N° 2, una CDR2 que consiste en la SEC ID N° 21, y una CDR3 que consiste en la SEC ID N° 22.

2. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso en la reivindicación 1 (a), en el que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende un dominio Vh que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° 4.

3. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso en la reivindicación 1 (a), o reivindicación 2, en el que el anticuerpo comprende un dominio Vl que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° 9.

4. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso en la reivindicación 1 (b), en el que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende un dominio Vh que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° 14.

5. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso en la reivindicación 1 (b), o reivindicación 4, en el que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende un dominio Vl que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° 19.

6. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso en una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo pollclonal, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado, o un anticuerpo humano.

7. Un procedimiento de diagnostico de un carcinoma hepatocelular en un sujeto, que comprende detectar el nivel de proteína PLVAP en una muestra del sujeto y determinar que el nivel de la proteína PLVAP en la muestra está aumentado respecto a un control, en el que el nivel de proteína PLVAP en una muestra del sujeto se detecta usando un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende

a) un dominio variable de anticuerpo que comprende una CDR1 que consiste en la SEC ID N° 5, una CDR2 que consiste en la SEC ID N° 6, y una CDR3 que consiste en la SEC ID N° 7; y un dominio variable de anticuerpo que comprende una CDR1 que consiste en la SEC ID N° 1, una CDR2 que consiste en la SEC ID N° 11, y una CDR3 que consiste en la SEC ID N° 12; o

b) un dominio variable de anticuerpo que comprende una CDR1 que consiste en la SEC ID N° 15, una CDR2 que consiste en la SEC ID N° 16, y una CDR3 que consiste en la SEC ID N° 17 y un dominio variable de anticuerpo que comprende una CDR1 que consiste en la SEC ID N° 2, una CDR2 que consiste en la SEC ID N° 21, y una CDR3 que consiste en la SEC ID N° 22.

8. El procedimiento de la reivindicación 7 (a), en el que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende un dominio Vh que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° 4.

9. El procedimiento de la reivindicación 7 (a), o reivindicación 8, en el que el anticuerpo comprende un dominio Vl que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° 9.

1. El procedimiento de la reivindicación 7 (b), en el que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende un dominio Vh que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° 14.

11. El procedimiento de la reivindicación 7 (b), o reivindicación 1, en el que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende un dominio Vl que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° 19.

12. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11, en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado, o un anticuerpo humano.

13. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12, en el que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo está marcado con un isótopo radiactivo.