Procedimiento y sistema para el análisis de las reacciones usando un sistema de información.

Un procedimiento para determinar si una muestra de ensayo contiene un ácido nucleico diana,

comprendiendo el procedimiento:

(a) poner en contacto la muestra de ensayo con al menos un agente de amplificación;

(b) amplificar al menos una porción del ácido nucleico diana en la muestra;

(c) medir señales obtenidas en varios puntos de la reacción de amplificación, siendo las señales proporcionales a la cantidad de ácido nucleico diana presente;

(d) determinar una eficacia relacionados con transformada de la reacción de amplificación, en la que la eficacia relacionada con transformada de la reacción de amplificación es una serie de relaciones calculadas a partir de mediciones secuenciales de las señales obtenidas de la amplificación, indexándose cada una de la serie de proporciones a un valor de tiempo o ciclo número;

(e) determinar un valor relacionado con la eficacia que es la magnitud máxima de la transformadas relacionadas con la eficacia; y

(f) determinar que la muestra de prueba contiene un ácido nucleico diana si el valor de eficacia relacionado para la reacción de amplificación excede un valor seleccionado, realizándose la etapa de determinar si el valor de eficacia relacionado excede un valor seleccionado mediante la comparación de la eficacia valor relacionado con una curva de criterio, donde la curva de criterios se determina por:

llevar a cabo una pluralidad de reacciones de amplificación en las muestras negativas, siendo dichas muestras negativas muestras que carecen del ácido nucleico diana;

determinar el valor de eficacia relacionado para cada muestra negativa;

determinar la media y la desviación estándar de los valores relacionados con la eficacia de las muestras negativas; y

determinar que cualquier muestra que tenga cualquier valor relacionado eficacia superior a la media por un múltiplo seleccionado de la desviación estándar de los valores relacionados con la eficacia de las muestras negativas contiene el ácido nucleico diana.

Procedimiento y sistema para el análisis de las reacciones usando un sistema de información Antecedentes de la intención 1. Campo de la invención La presente invención se refiere al análisis de los datos de las reacciones de amplificación de ácidos nucleicos. Más específicamente, la invención se refiere a un sistema de información y un procedimiento para hacer determinaciones con respecto a productos químicos y/o reacciones biológicas. La invención también incluye un procedimiento alternativo para la cuantificación de ácidos nucleicos en una muestra que comprende la amplificación de un ácido nucleico diana y el análisis de los datos obtenidos durante la reacción de amplificación. La invención implica además un sistema de diagnóstico y/o un equipo usando la amplificación de ácido nucleico en tiempo real, incluyendo, pero no limitado a, análisis de PCR.

2. Descripción de la técnica En muchos campos diferentes industriales, médicos, biológicos y/o de investigación, es deseable determinar la cantidad de un ácido nucleico de interés. Algunos procedimientos de cuantificación de ácidos nucleicos de interés implican la amplificación de los mismos y la observación de una señal proporcional a la cantidad de productos amplificados hecha; otros procedimientos implican la generación de una señal en respuesta a la presencia de un ácido nucleico diana, cuya señal se acumula con la duración de la reacción de amplificación. Como se usa aquí, la reacción de amplificación de ácido nucleico se refiere tanto a la amplificación de una porción de la secuencia de un ácido nucleico diana y la amplificación y la acumulación de una señal indicativa de la presencia de un ácido nucleico diana, con la primera a menudo se prefiere este último. La cuantificación de ácidos nucleicos se hace más difícil o menos precisa o ambos porque los datos capturados durante las reacciones de amplificación son a menudo significativamente oscurecidos por señales que no se generan en respuesta al ácido nucleico diana (es decir, ruido) . Por otra parte, los datos capturados por muchos procedimientos de monitoreo pueden estar sujetos a variaciones y falta de reproducibilidad debido a las condiciones que pueden cambiar durante una reacción o cambiar entre las diferentes instancias de una reacción. En vista de lo anterior, existe una necesidad de desarrollar mejores medios de cuantificación de un ácido nucleico. Cuando la cuantificación de ácidos nucleicos está habilitada por reacciones de amplificación, también hay una necesidad de mejorar los procedimientos actuales de detección de reacciones de amplificación sospechosas o no válidas. Queda además una necesidad de mejorar las capacidades actuales de distinguir entre las reacciones de amplificación que no detectan un ácido nucleico diana (es decir, reacciones negativas) a partir de las señales débiles obtenidas a partir de las reacciones de amplificación que sufren de bajas cantidades de un ácido nucleico diana en una muestra, un grado de inhibición de la reacción de amplificación, u otras causas. La presente invención proporciona mejoras en estas áreas, como se describe a continuación.

Una lista no exhaustiva de referencias que proporcionan información de antecedentes en relación con la presente invención de la siguiente manera:

Livak, K. y Schmittgen, T. , Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and 22DDCT Method, METHOD 25: 402-408 (2001) doi: 10. 1006/meth. 2001-1262, Bustin SA, Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription PCR assays, Journal of Molecular Endocrinology 25: 169-193 (2000) . Bustin SA, Quantification of mRAN using real-time reverse transcription PCR: trends and problems, J Mol Endocrinol. 29: 23-29 (2002) . Aunque los inventores no pueden garantizar que la siguiente página web seguirá estando disponible y no necesariamente aprueba las opiniones expresadas en el mismo, una persona interesada puede referirse a la página web www.wzw.turn.de/gene-quantification/index.shtml para información de referencia útil.

La descripción de cualquier obra, publicaciones, ventas o actividad en cualquier parte en la presente comunicación, incluidas en los documentos presentados con esta solicitud, no está destinada a ser una admisión de ninguna manera que cualquier tipo de trabajo constituye la técnica anterior, a menos que se indique expresamente lo contrario. Del mismo modo, la discusión de cualquier actividad, obra o publicación en este documento no es una admisión de que tal actividad, obra o publicación era conocida en cualquier jurisdicción en particular.

La PCR en tiempo real es una reacción de amplificación utilizada para la cuantificación de ácidos nucleicos diana en una muestra de ensayo. Expertos calificados convencionalmente suelen ver la reacción de amplificación comprendiendo tres fases distintas. En primer lugar, hay una fase de fondo o de línea de base, en la que se amplifica el ácido nucleico diana pero la señal proporcional a la cantidad de la diana de ácido nucleico no se puede detectar debido a que es demasiado pequeña para ser observada en relación con las señales independientes de la diana (a veces llamado "fondo" o "señal de fondo") . A continuación, hay una fase logarítmica en la que la señal crece sustancialmente de forma logarítmica porque la señal es sustancialmente proporcional a la cantidad de ácido nucleico diana en la reacción de amplificación y es mayor que la señal de fondo. Finalmente, el crecimiento de la

señal disminuye durante una fase de "meseta" que refleja menos que amplificación logarítmica del ácido nucleico diana. Como es conocido en la técnica, el tiempo en el que la fase logarítmica cruza un valor umbral, que es un valor algo mayor que el valor de la señal de fondo, está reproduciblemente relacionado con el logaritmo de la concentración del ácido nucleico diana. Este procedimiento de la técnica anterior se conoce genéricamente como el procedimiento Ct, tal vez llamado así por el Ciclo en que la señal cruza el umbral. El análisis Ct es razonablemente reproducible y preciso, pero sufre de algunos inconvenientes, que no necesitan ser discutidos aquí para entender la presente invención.

La patente US No. 6.303.305 o su miembro de la familia EP, a saber, EP 1 041 158 A2, describen un procedimiento de cuantificación de ácidos nucleicos que emplean reacciones de PCR. El procedimiento descrito utiliza la derivada enésima de la curva de crecimiento de una reacción de amplificación de ácido nucleico fluorescente. Este procedimiento evita de manera efectiva la necesidad de realizar una corrección de línea de base, pero no proporciona un procedimiento fiable para determinar muestras reactivas de no reactivas, y no sugiere razonablemente cómo utilizar un cálculo de la derivada enésima para evaluar la validez de los resultados obtenidos. Además, las señales de amplificación de ácidos nucleicos resultantes de cualquier artefacto en el sistema (por ejemplo, la diafonía o solapamiento positivo -definido infra) no se pueden distinguir de las verdaderas respuestas positivas utilizando los procedimientos descritos en el mismo y pueden dar lugar a resultados falsos positivos. Sin embargo, el cálculo de la derivada primera divulgada por la Patente US No. 6.303.305 proporciona un valor relacionado con la eficacia que es útil en el contexto de la presente invención. El experto en la materia puede referirse a la patente US No. 6.303.305 para detalles adicionales relacionados con el cálculo de una primera derivada de una curva de crecimiento de la señal de amplificación de ácido nucleico. La Patente US No. 6.303.305 también describe el cálculo de la primera derivada de una curva de crecimiento de amplificación de ácido nucleico. Sin embargo, la Patente US No. 6.303.305 no describe ni sugiere el uso de este valor de eficacia relacionado descrito en esta descripción (abajo) .

La solicitud de patente provisional en copropiedad No. 60/527.389, presentada el 6 de diciembre de 2003, describe un procedimiento para analizar una reacción de amplificación de ácido nucleico en el cual se examina el registro de la señal a partir de una reacción de amplificación para el gradiente o pendiente máximos. Este valor, que para cualquier conjunto de datos corresponde a un punto de un cierto período de tiempo o número de ciclos después de la iniciación de la reacción de amplificación, se llama el MGL de la reacción. El MGL es útil en ciertas realizaciones de la presente invención, particularmente en las que distinguen cualitativamente aquellas muestras que comprenden el ácido nucleico diana poco de aquellas muestras que no contienen el ácido nucleico diana.

El documento EP1 138 784 A2 se refiere... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para determinar si una muestra de ensayo contiene un ácido nucleico diana, comprendiendo el procedimiento:

(a) poner en contacto la muestra de ensayo con al menos un agente de amplificación;

(b) amplificar al menos una porción del ácido nucleico diana en la muestra;

(c) medir señales obtenidas en varios puntos de la reacción de amplificación, siendo las señales proporcionales a la cantidad de ácido nucleico diana presente;

(d) determinar una eficacia relacionados con transformada de la reacción de amplificación, en la que la eficacia relacionada con transformada de la reacción de amplificación es una serie de relaciones calculadas a partir de mediciones secuenciales de las señales obtenidas de la amplificación, indexándose cada una de la serie de proporciones a un valor de tiempo o ciclo número;

(e) determinar un valor relacionado con la eficacia que es la magnitud máxima de la transformadas relacionadas con la eficacia; y

(f) determinar que la muestra de prueba contiene un ácido nucleico diana si el valor de eficacia relacionado para la reacción de amplificación excede un valor seleccionado, realizándose la etapa de determinar si el valor de eficacia relacionado excede un valor seleccionado mediante la comparación de la eficacia valor relacionado con una curva de criterio, donde la curva de criterios se determina por:

llevar a cabo una pluralidad de reacciones de amplificación en las muestras negativas, siendo dichas muestras negativas muestras que carecen del ácido nucleico diana; determinar el valor de eficacia relacionado para cada muestra negativa; determinar la media y la desviación estándar de los valores relacionados con la eficacia de las muestras negativas; y determinar que cualquier muestra que tenga cualquier valor relacionado eficacia superior a la media por un múltiplo seleccionado de la desviación estándar de los valores relacionados con la eficacia de las muestras negativas contiene el ácido nucleico diana.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, donde se considera cualquier muestra que tiene cualquier valor relacionado eficacia superior a la media de una a aproximadamente 20 veces la desviación estándar de la eficacia relacionadas con transformada de las muestras negativas para contener un ácido nucleico diana.

3. El procedimiento de la reivindicación 1, donde el valor seleccionado de la etapa (e) varía de acuerdo con el punto de reacción particular en la que se produce el valor de eficacia relacionado.

4. El procedimiento de la reivindicación 1, donde el valor seleccionado de la etapa (e) se determina por (1) amplificación de una pluralidad de muestras para determinar los valores relacionados con la eficacia y (2) selección de un valor que es mayor que todos los valores relacionados con la eficacia de las muestras negativas.

5. El procedimiento de la reivindicación 1, donde el valor de eficacia relacionado es la proporción máxima de la respuesta de amplificación.

6. Un procedimiento para determinar si una muestra de ensayo contiene un ácido nucleico diana, comprendiendo el procedimiento:

(a) poner en contacto la muestra de ensayo con al menos un agente de amplificación;

(b) amplificar al menos una porción del ácido nucleico diana en la muestra;

(c) medir señales obtenidas en varios puntos de la reacción de amplificación, siendo las señales proporcionales a la cantidad de la presente ácido nucleico diana;

(d) determinar una transformada relacionada con la eficacia de la reacción de amplificación, en la que la eficacia relacionados con transformada de la reacción de amplificación es una serie de relaciones calculadas a partir de mediciones secuenciales de las señales obtenidas de la amplificación, siendo cada una de la serie de ratios indexada a un valor de tiempo o número de ciclo;

(e) determinar un valor relacionado con la eficacia que es la magnitud máxima de la transformadas relacionadas con la eficacia; y

(f) determinar que la muestra de ensayo contiene un ácido nucleico diana si el valor relacionado con la eficacia para la reacción de amplificación excede un valor seleccionado, donde el valor seleccionado se determina por (1) amplificar una pluralidad de muestras para determinar los valores relacionados con la eficacia y (2) seleccionar un valor que separa los valores relacionados con la eficacia de las muestras negativas de los valores relacionados con la eficacia de las muestras positivas.

7. El procedimiento de la reivindicación 6, donde se considera que cualquier muestra que tenga cualquier valor relacionado con la eficacia superior a la media en uno a aproximadamente 20 veces la desviación estándar de la transformada relacionada con la eficacia de las muestras negativas contiene un ácido nucleico diana.

8. El procedimiento de la reivindicación 6, donde el valor seleccionado de la etapa (e) varía de acuerdo con el punto de reacción particular en la que se produce el valor de eficacia relacionado.

9. El procedimiento de la reivindicación 6, donde el valor seleccionado de la etapa (e) se determina (1) amplificando una pluralidad de muestras para determinar los valores relacionados con la eficacia y (2) seleccionando de un valor que es mayor que todos los valores relacionados con la eficacia de las muestras negativas.

10. El procedimiento de la reivindicación 6, donde el valor de eficacia relacionado es la proporción máxima de la 10 respuesta de amplificación.