Procedimiento y kit de diagnóstico de epidermólisis bullosa juntural en ganado ovino.

Procedimiento y kit de diagnóstico de epidermólisis bullosa juntural en ganado ovino.

Procedimiento de diagnóstico de epidermólisis bullosa juntural en ganado ovino que comprende la detección de la presencia o ausencia de un fragmento de ADN del gen ITGB4 ovino, identificado por la secuencia de nucleótidos ccac, en una muestra biológica obtenida de ganado ovino. Kit para realizar este procedimiento, que comprende los cebadores identificados por las secuencias SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

El campo de la invención es el diagnóstico de enfermedades genéticas de herencia mendeliana simple (monogénica) en animales domésticos. En particular, la presente invención se refiere a la detección de la mutación responsable de la enfermedad genética denominada epidermólisis bullosa juntural o de la unión en el ganado ovino y al método de determinación del estatus genético de un individuo (sano, portador, enfermo) en relación con esta enfermedad.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El término epidermólisis bullosa hereditaria incluye una serie de procesos de base genética cuyo rasgo común es una marcada fragilidad de la piel y mucosas que desencadena la facilidad para desarrollar ampollas y úlceras por trauma o roce.

Existen diversos tipos de epidermólisis bullosa siendo la clasificación más aceptada la que distingue tres tipos principales: (i) epidermólisis bullosa simple, donde se producen ampollas intraepidérmicas que curan sin cicatriz, (ii) epidermólisis bullosa de la unión o juntural en la que las ampollas se deben a una formación anormal de los componentes de los hemidesmosomas, lo que da lugar a roturas a nivel de la lámina lúcida, y (iii) epidermólisis bullosa distrófica, que se produce a nivel de la lámina basal epidérmica, y en la que las ampollas subepidérmicas se reparan con cicatrices distróficas.

En el ganado ovino de raza Black Headed Mutton (BHM) se ha descrito recientemente una mutación en el gen LAMC2, que codifica para la laminina subunidad gamma-2 (Momke S. et al., 2011. A frameshift mutation within LAMC2 is responsible for Herlitz type junctional epidermolysis bullosa (HJEB) in black headed mutton sheep. PLoS One 6(5):e18943). Sin embargo, existen otros genes que pueden causar la EBJ como es el caso del LAMA3, LAMB3, COL17A1, ITGB4 e ITGA6 (Siañez-González C. et al., 2009. Epidermólisis ampollosa congénita: revisión del tema. Actas Dermosifiliográficas 100(10):842-56).

El procedimiento diagnóstico de la EBJ descrito en la presente invención se basa en la identificación de una mutación asociada a la enfermedad EBJ en un fragmento del gen ITGB4, que codifica para la proteína Integriña-beta 4. La Integrina-beta 4 es una proteína expresada principalmente en la membrana basal epitelial formando parte de la placa externa de los hemidesmosomas. Esta proteína contribuye a la estabilidad de la unión de la epidermis con la membrana basal subyacente.

Según la base de datos Online Mendelian Inheritance in Men (OMIM), las mutaciones en el gen ITGB4 se relacionan principalmente con tres fenotipos: Epidermolisis hullosa de manos y pies (OMIM: 131800), epidermolisis hullosa juntural, tipo non-Herlitz (OMIM:226650) y epidermolisis hullosa juntural con atresia pilórica (OMIM:226730).

El gen ITGB4 está situado en el cromosoma ovino 11 (OAR11), en la región 54.848.050- 54.874.496 pb según la versión Oarv3.1 del genoma ovino ( http://www.ensembl.org/Ovis aries/lnfo/lndex), y está organizado en un total de 38 exones (GenBankAcc. no.: KP025765).

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

Una realización es un procedimiento de diagnóstico de epidermolisis hullosa juntural en ganado ovino que comprende la detección de la presencia o ausencia de un fragmento de ADN del gen ITGB4 ovino, identificado por la secuencia de nucleótidos ccac, en una muestra biológica obtenida de ganado ovino, en adelante procedimiento de la invención.

El fragmento de ADN identificado por la secuencia de nucleótidos ccac corresponde a una deleción de 4 pb entre las posiciones 4412 y 4415 de la secuencia codificante del ARNm del gen ITGB4 ovino disponible en GenBank (Acc. no. KP025765) correspondiente a las posiciones 54849767 y 54849770 pb en la secuencia de ADN del genoma ovino (Oarv3.1), en el exón 33 (posiciones 30204 a 30207), según la anotación del gen disponible en GenBank (Acc. no. KP025765). Esta deleción se ha identificado por primera vez en la presente invención como responsable de la epidermolisis hullosa juntural en oveja, mediante un estudio comparado de la secuencia codificante de este gen en animales enfermos y sanos.

El procedimiento de la invención permite detectar individuos sanos portadores de la enfermedad. Dichos portadores serán heterocigotos para la deleción de 4 pb localizada en el

exón 33 del gen, es decir tendrán una copia del gen completa y otra copia portadora de la deleción.

Otra realización es el procedimiento de la invención, donde dicha detección se realiza con un biosensor o microarray.

Otra realización es el procedimiento de la invención, que comprende:

(a) amplificar por PCR en dicha muestra biológica un fragmento de ADN situado entre los cebadores con una identidad de al menos 80% respecto a las secuencias SEQ ID NO: 1 y 2,

(b) determinar el número y tamaño de los fragmentos de ADN resultantes de dicha amplificación y

(c) realizar un diagnóstico de epidermólisis bullosa juntural a partir de la información obtenida en el paso (b).

En la presente solicitud, dicho porcentaje de identidad en una secuencia determinada se calcula teniendo en cuenta que un 80% de identidad significa que un 80% de residuos de la secuencia completa de los cebadores identificados por las secuencias SEQ ID NO: 1 y 2 son idénticos a los residuos de la secuencia determinada.

Otra realización es el procedimiento de la invención, donde en la etapa (b) el número y tamaño de los fragmentos de ADN se determina por electroforesis.

Otra realización es el procedimiento de la invención, en el que antes de la etapa (a) se realiza una extracción de ADN de dicha muestra biológica.

La extracción del ADN a partir de estas muestras se puede realizar por métodos como el fenol-cloroformo descrito en Sambrook, 1989 (Sambrook, J. et. al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd edition. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press); por el método "Salting out" descrito en Miller, 1988 (MILLER, S.A. et al, 1988. A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells. Nucleic acids research, 16(3), pp. 1215) en el caso del semen o la utilización de Chelex-100 (BioRad Laboratories, Hercules, CA) para la extracción a partir de muestras de pelo. La extracción del ADN también se puede realizar utilizando Kits comerciales de extracción de ADN, sobre todo para muestras de saliva o de muestras de flujo nasal en las que se parte de una escasa cantidad de células nucleadas.

Otra realización es el procedimiento de la invención, donde dicha identidad de secuencia es de al menos 90%.

Otra realización es el procedimiento de la invención, donde dichos cebadores están identificados por las secuencias SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3.

Otra realización es el procedimiento de la invención, donde al menos uno de dichos cebadores está unido a una molécula marcadora. En una realización particular, dicha molécula marcadora está seleccionada del grupo compuesto por 6-carboxi-fluoresceína, hexacloro-fluoresceína y tetracloro-fluoresceína. Estas moléculas marcadores podrían ser reemplazadas por otros moléculas marcadoras.

Otra realización es el procedimiento de la invención, donde dicha muestra biológica está seleccionada del grupo compuesto por pelo, tejido, célula o fluido biológico.

Otra realización es el procedimiento de la invención, donde dicho fluido biológico está seleccionado del grupo compuesto por saliva, leche, suero, plasma sanguíneo, sangre, semen y fluido nasal.

Otra realización es un kit para realizar el procedimiento de la invención, que comprende los cebadores identificados por las secuencias SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2.

El procedimiento de la invención constituye un método sencillo, rápido y económico de detección de animales portadores, evitando que animales heterocigotos puedan seleccionarse para reposición en el rebaño y ser incluidos en el programa de mejora correspondiente, hechos que favorecerían la diseminación de la enfermedad.

El procedimiento de la invención puede utilizarse también para la detección de animales portadores en el caso de cruzamientos programados para obtener animales que sirvan como modelo animal en el estudio de la enfermedad.

El procedimiento de la invención puede aplicarse a corderos que presenten lesiones cutáneas compatibles con la enfermedad con el fin de descartarla sin necesidad de realizar una necropsia.

TEXTO LIBRE DE LA LISTA DE SECUENCIAS

A continuación se aporta una traducción del texto libre en inglés que aparece en la lista de secuencias.

SEQ ID NO: 1. Cebador sentido para PCR.

SEQ ID NO: 2. Cebador antisentido para PCR.

SEQ ID NO: 3. Fragmento del gen salvaje ovino...

1. Procedimiento de diagnóstico de epidermólisis bullosa juntural en ganado ovino que comprende la detección de la presencia o ausencia de un fragmento de ADN del gen ITGB4 ovino, identificado por la secuencia de nucleótidos ccac, en una muestra biológica obtenida de ganado ovino.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado por que comprende:

(a) amplificar por PCR en dicha muestra biológica un fragmento de ADN situado entre los cebadores con una identidad de al menos 80% respecto a las secuencias SEQ ID NO: 1 y 2,

(b) determinar el número y tamaño de los fragmentos de ADN resultantes de dicha amplificación y

(c) realizar un diagnóstico de epidermólisis bullosa juntural a partir de la información obtenida en el paso (b).

3. Procedimiento según la reivindicación 2, caracterizado por que antes de la etapa (a) se realiza una extracción de ADN de dicha muestra biológica.

4. Procedimiento según la reivindicación 2, caracterizado por que dicha identidad de secuencia es de al menos 90%.

5. Procedimiento según la reivindicación 2, caracterizado por que dichos cebadores están identificados por las secuencias SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2.

6. Procedimiento según la reivindicación 2, caracterizado por que al menos uno de dichos cebadores está unido a una molécula marcadora.

7. Procedimiento según la reivindicación 6, caracterizado por que dicha molécula marcadora está seleccionada del grupo compuesto por 6-carboxi-fluoresceína, hexacloro-fluoresceína y tetracloro-fluoresceína.

8. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado por que dicha detección se realiza con un biosensor o microarray.

9. Procedimiento según la reivindicación 2, caracterizado por que en la etapa (b) el número y tamaño de los fragmentos de ADN se determina por electroforesis.

10. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado por que dicha muestra biológica está seleccionada del grupo compuesto por pelo, tejido, célula o fluido biológico.

11. Procedimiento según la reivindicación 10, caracterizado por que dicho fluido biológico está seleccionado del grupo compuesto por saliva, leche, suero, plasma sanguíneo, sangre, semen y fluido nasal.

12. Kit para realizar el procedimiento según la reivindicación 2, caracterizado por que comprende los cebadores identificados por las secuencias SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2.