Procedimiento mejorado de detección de bacterias acidorresistentes del género Helicobacter en las heces.

Procedimiento para la detección de una infección de una bacteria acidorresistente del género Helicobacter en un mamífero,

en el que (a) se incuba una muestra de excrementos del mamífero empleando (aa) un receptor en condiciones que permitan la formación de un complejo de un antígeno de la bacteria acidorresistente con el receptor; o (ab) se incuban dos receptores distintos en condiciones que permitan la formación de un complejo de un antígeno de la bacteria acidorresistente con los dos receptores y en el que el receptor según (aa) o los receptores según (ab) se une(n) específicamente a un antígeno que, por lo menos en una parte del mamífero después de haber pasado el tracto intestinal, presenta una estructura que corresponde a la estructura nativa o a la estructura frente a la cual un mamífero produce o genera anticuerpos después de una infección o inmunización con la bacteria acidorresistente o con un extracto o con un lisado de la misma o con un fragmento de la misma o con un péptido sintético; y (b) se detecta la formación de un complejo de antígeno- receptor según (a).

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HP25.2m/2H10: sensibilidad y especificidad en ELISA sandwich (anticuerpo capturador pAK contra H. pylori)

CX2019 POSITIVO 0, 59 positivo

CX2029 POSITIVO 0, 52 positivo

CX0213 POSITIVO 0, 04 negativo

CX294-1 POSITIVO 0, 14 positivo

CX3098 POSITIVO 0, 13 positivo

CX3146 POSITIVO 0, 05 negativo

CX3148 POSITIVO 0, 08 negativo

CX3234 POSITIVO 0, 18 positivo

CX4003 POSITIVO 0, 17 positivo

CX4006 POSITIVO 0, 25 positivo

CXT001 POSITIVO 0, 23 positivo

CXT002 POSITIVO 0, 53 positivo

CXT003 POSITIVO 0, 12 positivo

CXT004 POSITIVO 0, 03 negativo

CXT005 POSITIVO 0, 03 negativo

CXT006 POSITIVO 0, 31 positivo

CXT007 POSITIVO 0, 08 negativo

CX1008 NEGATIVO 0, 29 positivo

CX1031 NEGATIVO 0, 08 negativo

CX1049 NEGATIVO 0, 7 positivo

CX1051 NEGATIVO 0, 09 negativo

CX0142 NEGATIVO 0, 03 negativo

CX0185 NEGATIVO 0, 03 negativo

CX0189 NEGATIVO 0, 08 negativo

CX0193 NEGATIVO 0, 03 negativo

CX2010 NEGATIVO 0, 08 negativo

CX2018 NEGATIVO 0, 09 negativo

CX0220 NEGATIVO 0, 03 negativo

CX0231 NEGATIVO 0, 03 negativo

CX0258 NEGATIVO 0, 02 negativo

CX3008 NEGATIVO 0, 09 positivo

CX3011 NEGATIVO 0, 08 negativo

CX3033 NEGATIVO 0, 07 negativo

CX3035 NEGATIVO 0, 09 negativo

Abreviaturas: pAK = anticuerpo policlonal; HP = H. pylori

Tabla 3

Caracterización de anticuerpos monoclonales contra catalasa

fusión/clon isotipo WB (Ag) NWG (mg/ml) muestras de heces reconocidas correctamente

muestras pos. muestras neg.

HP25.2m/2H10 IgG2a, κ + 1, 5 17 de 25 14 de 17

HP25.6m/1G4 IgG1, κ + 1, 5 4 de 5 2 de 2

HP25.6m/1B5 IgG1, κ + 3-6 3 de 5 2 de 2

HP25.6m/1H4 IgG1, κ + 3-6 2 de 5 2 de 2

HP25.6m/4E3 IgG1, κ + 6 2 de 5 2 de 2

HP25.6m/1A5 IgG1, κ + 6 2 de 5 2 de 2

HP25.6m/5E4 IgG1, κ - 1, 5 1 de 5 2 de 2

HP25.6m/4A12 IgG1, κ - 1, 5 1 de 5 2 de 2

HP25.6m/5F4 IgG1, κ - 1, 5 1 de 5 2 de 2

Abreviaturas: Ag = antígeno; WB = Westernblot; NWG = límite de detección

Resultados La tabla 3 recoge los resultados de la determinación de isotipo, de los análisis Westernblot, de la determinación del límite de detección y del reconocimiento de paciente para anticuerpos monoclonales (mAK) contra la catalasa. De los dados se desprende que un buen reconocimiento de la catalasa nativa con mAK no guarda relación con un buen reconocimiento del paciente.

En el ensayo ELISA sandwich mixto, policlonal/monoclonal, el mAK HP25.2m/2H10 presentó una sensibilidad del 68 % y una especificidad del 82 %. Cabe esperar una mejora de la sensibilidad y de la especificidad con el uso de mAk

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purificado (en lugar de sobrenadante de cultivo) en un sistema ELISA exclusivamente monoclonal. Para ello pueden utilizarse ya sea un anticuerpo monoclonal, dirigido contra el mismo epítope del antígeno (ver ejemplo 10) , ya sea dos anticuerpos monoclonales distintos, dirigidos contra distintos epítopes del mismo antígeno (ver ejemplo 12) , en calidad de anticuerpos capturadores y detectores.

Ejemplo 10

Detección de H. pylori en heces humanas mediante el ensayo ELISA (sistema exclusivamente monoclonal)

Para el ensayo se disponía de muestras de excrementos de pacientes de diez clínicas distintas o de consultas médicas gastroenterológicas, cuyo estado de infección con H. pylori se había determinado por ensayo respiratorio de urea-C13 y/o análisis histológicos de biopsias gástricas. Las muestras de excrementos a analizar se codificaron de modo que el personal del laboratorio no conocía de antemano el estado de infección.

Ensayo ELISA sandwich de heces con H. pylori (ELISA de tres etapas)

El recubrimiento de las placas ELISA (MaxiSorb; Nunc) se efectuó a 37º C durante 1 h con 100 μl de una solución de mAK (20, 0 μg de HP25.2m/2H10 / ml de tampón carbonato 0, 1 M, pH 9, 5) . Para bloqueo de los sitios de fijación todavía libres se pipetearon a cada hoyo 200 μl de PBS 150 mM con un 0, 2 % de gelatina de pescado (p/v) y se incubó a temperatura ambiente durante 30 min. A continuación se realizó un doble lavado con 250 μl del tampón de lavado 1 (PBS con un 0, 025 % de Tween) . Se suspendieron los excrementos humanos en proporción 1:10 (p/v) con 150 mM de PBS añadiendo leche desnatada en polvo al 2 % y EDTA 1 mM. Para determinar el límite de detección del antígeno se añadió catalasa de H. pylori en concentraciones conocidas a la suspensión de excrementos de un paciente negativo en H. pylori. Se centrifugaron las suspensiones de muestras de heces a 7000 rpm durante 5 min. Se incubó en cada hoyo 100 μl del sobrenadante durante 1 h. Se vació la placa, se enjuagó y se lavó 4 veces con solución de lavado 2 (250 μl de PBS al que se añadió un 0, 2 % de Tween) . A continuación se añadieron 100 μl de una solución de mAK unido a biotina (1 μg/ml de HP25.2m/2H10-Bio en PBS; 0, 1 % de BSA) y se incubaron a temperatura ambiente durante 60 min. La detección de los antígenos unidos se realizó por adición de un conjugado de estreptavidina con POD (Dianova) . La POD hace virar en una primera etapa el sustrato incoloro TMB (Sigma) a un producto azul. Pasados de 5 a 10 minutos, con preferencia 10 minutos, se interrumpió la reacción enzimática por adición de ácido sulfúrico 1N (100 μl/hoyo) . La intensidad de la reacción de color se midió en un lector ELISA (MWG Spektral) . La medición se realiza a 455 nm frente a la longitud de onda de referencia de 620 nm, o de 630 nm.

Tabla 4

Detección de catalasa de H. pylori en heces mediante ensayo ELISA empleando el anticuerpo monoclonal HP25.2m/2H10 como anticuerpo capturador y detector

paciente estado clínico ELISA-heces-HP OD (450630) paciente estado clínico ELISA-heces-HP OD (450630)

1001 negativo 0, 069 1003 positivo 0, 475

1002 negativo 0, 104 1013 positivo 4, 087

1007 negativo 0, 053 1014 positivo 0, 105

1008 negativo 0, 042 1015 positivo 2, 469

1010 negativo 0, 043 1028 positivo 0, 096

1012 negativo 0, 055 1029 positivo 4, 466

1017 negativo 0, 052 1037 positivo 2, 485

1021 negativo 0, 045 2001 positivo 0, 083

1022 negativo 0, 068 2003 positivo 0, 817

1024 negativo 0, 036 2005 positivo 1, 508

1025 negativo 0, 046 2008 positivo 4, 247

1027 negativo 0, 057 2009 positivo 1, 597

1030 negativo 0, 061 2016 positivo 2, 651

1031 negativo 0, 037 2022 positivo 0, 135

1032 negativo 0, 056 2029 positivo 3, 953

1034 negativo 0, 048 2032 positivo 3, 400

1035 negativo 0, 033 2035 positivo 3, 384

1040 negativo 0, 037 2039 positivo 0, 053

1046 negativo 0, 046 2040 positivo 4, 602

2002 negativo 0, 056 2041 positivo 0, 200

2006 negativo 0, 032 2042 positivo 4, 592

2007 negativo 0, 027 3146 positivo 1, 742

2010 negativo 0, 039 6014 positivo 2, 572

2012 negativo 0, 041 3149 positivo 0, 989

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paciente estado clínico ELISA-heces-HP OD (450630) paciente estado clínico ELISA-heces-HP OD (450630)

2013 negativo 0, 049 3153 positivo 4, 590

2014 negativo 0, 046 3570 positivo 4, 567

2015 negativo 0, 048 3577 positivo 4, 566

2017 negativo 0, 050 3215 positivo 4, 540

2018 negativo 0, 061 3219 positivo 4, 486

2023 negativo 0, 056 3220 positivo 4, 518

2024 negativo 0, 051 3231 positivo 4, 706

2028 negativo 0, 102 3234 positivo 4, 567

2033 negativo 0, 050 3235 positivo 4, 616

2034 negativo 0, 077 3241 positivo 3, 671

2043 negativo 0, 045 3243 positivo 4, 582

3123 negativo 0, 055 4003 positivo 4, 700

3213 negativo 0, 119 4005 positivo 0, 401

3214 negativo 0, 062 4006 positivo 4, 694

3224 negativo 0, 048 4018 positivo 4, 142

3225 negativo 0, 065 4019 positivo 2, 366

3236 negativo 0, 043 4020 positivo 1, 468

4004 negativo 0, 089 5001 positivo 4, 490

5004 negativo 0, 079 5002 positivo 3, 917

5007 negativo 0, 055 5003 positivo 4, 321

5008 negativo 0, 156 5006 positivo ... [Seguir leyendo]

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