Procedimiento de producción.

Un procedimiento para producir una línea celular de mamífero que produce al menos una proteína terapéutica que comprende las etapas de:

a) obtener una primera secuencia de polinucleótidos que codifica dicha al menos una proteínaterapéutica,

b) alterar la primera secuencia de polinucleótidos para obtener una segunda secuencia de polinucleótidos, en la que el índice de adaptación de codones de la segunda secuencia de polinucleótidos es mayor que la de la primera secuencia de polinucleótido y el primer polinucleótido y el segundo polinucleótido codifican la misma proteína terapéutica.

c) transformar al menos una primera célula de una línea celular de mamífero con la primera secuencia de polinucleótidos de la etapa (a) y una tercera secuencia de polinucleótidos que codifica un marcador de selección que es capaz de proporcionar la amplificación de la primera secuencia de polinucleótidos dentro de dicha célula; y

transformar al menos una segunda célula de dicha línea celular de mamífero con la segunda secuencia de polinucleótidos de la etapa (b) y una tercera secuencia de polinucleótidos que codifica el marcador de selección que es capaz de proporcionar la amplificación de la segunda secuencia de polinucleótidos dentro de dicha célula,

d) cultivar al menos una primera célula de la etapa (c) para crear una primera línea celular que comprende una pluralidad de células, en un medio que contiene una concentración o una concentración cada vez mayor de un agente de selección y amplificación que (i) inhibe el crecimiento de células en dicha línea celular que expresa niveles insuficientes del marcador de selección codificado por el tercer polinucleótido de la etapa (c), y (ii) aumenta el número de copias del gen;

cultivar al menos una segunda célula de la etapa (c) para crear una segunda línea celular que comprende una pluralidad de células, en un medio que contiene una concentración o una concentración cada vez mayor del agente de selección y amplificación que (i) inhibe el crecimiento de células en dicha línea celular que expresa niveles insuficientes del marcador de selección codificado por el tercer polinucleótido de la etapa (c), y (ii) aumenta el número de copias del gen; y

(e) seleccionar dicha segunda línea celular una vez que se alcanza la meseta de producción de la proteína codificada por el segundo polinucleótido en dicha segunda línea celular, en el que dicha concentración del agente de selección y amplificación es menor que la necesaria para alcanzar un rendimiento de producción equivalente de dicha proteína producida en dicha primera línea celular transformada con el primer polinucleótido.

Procedimiento de producción La presente invención proporciona un procedimiento para producir una línea celular que es capaz de secretar una proteína terapéutica. El procedimiento comprende el uso de secuencias génicas adaptadas por codones que tienen como resultado plazos de protocolo reducidos y una dsminución en las concentraciones de antifolato requeridas a la hora de generar, por ejemplo, líneas celulares productoras de anticuerpos mediante un sistema de selección y amplificación.

Las células de mamífero, tales como las células CHO (células de ovario de hámster chino) , NSO y PerC6 se usan de forma rutinaria en la industia farmacéutica para fabricar productos biofarmacéuticos. Estas células están modificadas genéticamente y, después, se seleccionan de un modo tal que se garantiza que se observa una expresión elevada de títulos de la proteína deseada cuando las líneas celulares resultantes se cultivan en biorreactores.

Actualmente existen varios proocedimientos para la modificación y, después, la selección de las células mejores para este fin. A menudo, estos procedimientos implican “amplificación" para aumentar el número de copias del vector o vectores de expresión integradas para mejorar los rendimientos observados de la proteína deseada. Estos procedimientos de “amplificación” se han descrito bien en Bebbington and Hentschel (DNA Cloning Volume III (IRL press, 1987) ) . Los autores explican que una serie de marcadores seleccionables (que a menudo están en forma de secuencias de ácido nucleico que codifican enzimas implicadas en el metabolismo y esenciales para la supervivencia de las células huésped en determinadas condiciones del medio de cultivo) se pueden unir de forma operativa a los vectores de expresión diseñados para expresar la proteína deseada de forma que tras la selección del marcador seleccionable, también se selecciona para la expresión de la proteína deseada. No obstante, dado que después de esta selección los títulos resultantes de la proteína deseada normalmente no son lo bastante altos, las células seleccionadas también se someten a regímenes de “amplificación”. Estos regímenes normalmente implicar someter las células a determinados fármacos tóxicos que inhiben el marcador seleccionable. Mediante dicha inhibición, se seleccionarán las poblaciones de células que presenten niveles de expresión aumentados de este marcador. A menudo esto conduce a niveles de expresión aumentados de los casetes de expresión unidos operativamente también. Dicha expresión aumentada o “amplificación” normalmente se produce debido a reorganizaciones genómicas resultantes en un mayor número de copias del marcador seleccionable y casetes de expresión unidos operativamente. A menudo, mediante dicha "coamplificación", los títulos mejoran suficientemente para usar los mejores clones resultantes para producir niveles adecuadamente elevados de la proteína o proteína deseadas. Cuando el número de copias del vector en células individuales sometidas a regímenes de amplificación se han investigado adicionalmente, se ha observado que hasta alcanzar una “meseta2 de la producción de proteínas, los niveles de producción observados normalmente son proporcionales al aumento del número de copias de los genes (Bebbington y Hentshcel ibid) .

Hasta la fecha se han identificado muchos marcadores seleccionables diferentes para amplificar y los denominados marcadores de selección amplificables. Cada uno identificado también tiene un agente de “selección y amplificación” asociado añadido al medio de cultivo celular durante los regímenes de selección y amplificación. Los ejemplos de dichas combinaciones de agentes / marcadores seleccionables incluyen: adenosina desaminasa / desoxicoformicina, aspartato transcarbamilasa/ N (fosfoacetil) -L-aspartato, dihidrofolato reductasa / metotrexato, glutamina sintetasa / metionina sulfoximina, metalltioneína-I / metal pesado, resistencia a múltiples fármacos / adriamicina (véase Bebbington y Hentschel ibid, Kellems 1991; Current Opinion in Biotechnology 2: pp723 -729) . Adicionalmente, más recientemente se ha notificado que los marcadores de selección de antibióticos, tales como los que confieren resistencia a neomicina/G418 y ceocina, también se pueden usar a veces para aumentar el número de copias y, por tanto, ha veces se han utilizado como marcadores de selección y amplificación cuando se combinan con el agente seleccionable (a base de antibióticos) de amplificación y selección afín adecuado (p. ej., Sauttle y Enenkel: Biotech Bioeng 2004 89 pp530 -538, y Kwaks et al: Nature Biotech 2003; 21; pp553 -558)

Aunque hay una serie de procedimientos para seleccionar las mejores células modificadas genéticamente para este fin, las dos presiones de selección más usadas son los procedimientos de selección basados en la glutamina sintetasa (GS) y dihidrofolato reductasa (DHFR) .

El procedimiento de la GS implica la unión operativa de un casete de expresión de glutamina sintetasa al del casete o casetes de expresión de proteínas terapéuticas. Los vectores unidos operativamente posteriores se liberan a las células y se selecciona a integración cromosómica en el vector para la depleción o eliminación de glutamina del medio en el que se cultivan las células. La adición de los inhibidores de la glutamina sintetasa, tales como metonina sulfoximina (MSX) , a menud se añaden a los medios de cultivo con el fin de asegurar que se selecciona la actividad de la glutamina sintetasa por encima y más allá de los niveles de las células huésped endógenos. El procedimiento de selección alternativo de la DHFR implica la unión operativa de una presión de selección de DHFR a la del casete casete o casetes de expresión de proteínas terapéuticas. Los vectores unidos operativamente se liberan a las células y se selecciona la integración cromosómica en el vector para la depleción o eliminación de nucleósidos (p. ej., hiposantina y timidina) . Normalmente para el procedimiento de la DHFR, es habitual usar cepas huésped negativas para la DHFR, tal como CHO DG44 o CHO DUX-B11. También es habitual emplear agentes de selección y de amplificación, tales como el metotrexato (MTX) .

La adición o ajuste gradual de cantidades crecientes de los agentes de selección y amplificación MSX o MTX en los respectivos sistemas de selección con GS y DHFR a menudo se realiza con el fin de aumentar la expresión mediante el aumento de número de copias del gen. Tales procedimientos pueden implicar la adición del agente de selección y amplificación para el cultivo de células directamente. Como alternativa, el agente puede añadirse al medio de crecimiento antes de los medios de comunicación que se utilizan en tal cultivo celular. Esta adición o titulación de tales agentes directos a los cultivos celulares o a los medios usados para los cultvos celulares normalmente se denomina “amplificación”. Por ejemplo, en el sistema de GS se pueden añadir o aumentar los niveles de MSX hasta y más allá de 500 μM, mientras que para el sistema DHFR, se pueden añadir o aumentar los niveles de MTC antifolato hasta y más allá de los niveles de concentración de 1 μM. Mediante el uso de tales agentes de esta manera, seguido de un período de cultivo para permitir la selección de células que crecen en la nueva concentración del agente de selección, (cada etapa de concentración se denomina una "ronda" de la amplificación) , se ha demostrado que el área del genoma que alberga la presión de selección también puede amplificarse, aumentando de ese modo el número de copias del marcador seleccionable. En consecuencia, cuando el marcador seleccionable está unido operativamente a los casetes de expresión de proteínas terapéuticas, estos casetes también pueden amplificarse. Por el uso de agentes de selección y amplificación adecuados cuando se utiliza el sistema de selección de GS y DHFR, los rendimientos de las proteínas deseadas se pueden mejorar significativamente hasta alcanzar una 'meseta de producción' (véase Bebbington y Hentschel (ibid) ) . Como consecuencia de ello, los clones que crecen a través de tal selección y amplificación se investigan después sobre el título / rendimiento y los mejores clones se seleccionan y se evalúan adicionalmente. A partir de esta titulación y cribado, es típico identificar y, después, comprometerse a un clon para la posterior producción de la proteína o proteínas deseadas.

Típicamente, tanto el número de “rondas'' de amplificación como la concentración del agente de selección y amplificación empleado no se establecen o fijan en los protocolos de selección y amplificación. .En cambio, es típico que de los regímenes... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para producir una línea celular de mamífero que produce al menos una proteína terapéutica que comprende las etapas de:

a) obtener una primera secuencia de polinucleótidos que codifica dicha al menos una proteína 5 terapéutica,

b) alterar la primera secuencia de polinucleótidos para obtener una segunda secuencia de polinucleótidos, en la que el índice de adaptación de codones de la segunda secuencia de polinucleótidos es mayor que la de la primera secuencia de polinucleótido y el primer polinucleótido y el segundo polinucleótido codifican la misma proteína terapéutica.

c) transformar al menos una primera célula de una línea celular de mamífero con la primera secuencia de polinucleótidos de la etapa (a) y una tercera secuencia de polinucleótidos que codifica un marcador de selección que es capaz de proporcionar la amplificación de la primera secuencia de polinucleótidos dentro de dicha célula; y

transformar al menos una segunda célula de dicha línea celular de mamífero con la segunda secuencia de polinucleótidos de la etapa (b) y una tercera secuencia de polinucleótidos que codifica el marcador de selección que es capaz de proporcionar la amplificación de la segunda secuencia de polinucleótidos dentro de dicha célula,

d) cultivar al menos una primera célula de la etapa (c) para crear una primera línea celular que comprende una pluralidad de células, en un medio que contiene una concentración o una concentración cada vez mayor de un agente de selección y amplificación que (i) inhibe el crecimiento de células en dicha línea celular que expresa niveles insuficientes del marcador de selección codificado por el tercer polinucleótido de la etapa (c) , y (ii) aumenta el número de copias del gen;

cultivar al menos una segunda célula de la etapa (c) para crear una segunda línea celular que comprende una pluralidad de células, en un medio que contiene una concentración o una concentración cada vez

mayor del agente de selección y amplificación que (i) inhibe el crecimiento de células en dicha línea celular que expresa niveles insuficientes del marcador de selección codificado por el tercer polinucleótido de la etapa (c) , y (ii) aumenta el número de copias del gen; y

(e) seleccionar dicha segunda línea celular una vez que se alcanza la meseta de producción de la proteína codificada por el segundo polinucleótido en dicha segunda línea celular, en el que dicha concentración del agente de selección y amplificación es menor que la necesaria para alcanzar un rendimiento de producción equivalente de dicha proteína producida en dicha primera línea celular transformada con el primer polinucleótido.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la meseta de producción de la proteína codificada por el segundo polinucleótido producido en dicha segunda línea celular se alcanza con un menor número de rondas de amplificación de lo necesario para alcanzar un rendimiento de producción equivalente de dicha proteína producida en dicha primera línea celular transformada con el primer polinucleótido.

3. El procedimiento de la reivindicación 1 o 2, en el que la segunda línea celular se cultiva en biorreactores y la proteína terapéutica producida se purifica.

4. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el índice de adaptación de codones 40 de la segunda secuencia de polinucleótidos es igual o superior a 0, 9.

5. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la concentración del agente de selección y amplificación se reduce a igual o menos del 50% o a menos del 25% o a menos del 5% o a menos del 3%, en comparación con la concentración del agente de selección y amplificación usado para el mismo procedimiento usando la primera secuencia de polinucleótidos.

6. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la proteína terapéutica es un anticuerpo, un derivado del mismo o un fragmento de unión a antígeno.

7. El procedimiento de la reivindicación 6, en el que la proteína terapéutica es un anticuerpo monoclonal.

8. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la línea celular de mamífero que se

va a transformar es metabólicamente deficiente debido a la interrupción o la inhibición de una enzima celular 50 endógena.

9. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la línea celular de mamífero que se va a transformar es deficiente en una vía de síntesis de nucleósidos.

10. El procedimiento de la reivindicación 9, en el que el marcador de selección es un polinucleótido que codifica la

dihidrofolato reductasa (DHFR) y el agente de selección y amplificación es un antifolato.

11. El procedimiento de la reivindicación 10, en el que el antifolato es metotrexato (MTX) .

12. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que el marcador de selección es un

polinucleótido que codifica la glutamina sintetasa y el agente de selección y amplificación es metionina 5 sulfoximina (MSX) .

13. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que solo se requiere una ronda de amplificación para alcanzar la meseta de producción de proteínas.

14. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que el rendimiento final de la proteína terapéutica es superior a 0, 5 g/l en un lote sin alimentar.

15. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 11, 13 or 14, en el que la concentración de MTX usada es:

(a) igual o inferior a 50nM; or

(b) 5nM.

16. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en el que la línea celular de mamífero es 15 CHO o NSO.

17. Uso de una secuencia de polinucleótidos que codifica una proteína terapéutica en la que el índice de adaptación de codones de la secuencia de polinucleótidos es igual o mayor que 0, 9 para reducid (i) los niveles requeridos de un agente de selección y amplificación titulable que aumenta el número de copias del gen, (ii) el número de rondas de amplificación, y (iii) el tiempo necesario en un procedimiento para producir una línea celular de mamífero productora de dicha proteína terapéutica.

18. Uso de acuerdo con la reivindicación 17, en el que sólo se requiere una ronda de amplificación.

19. Un procedimiento para producir una línea celular de mamífero que produce al menos una proteína terapéutica que comprende las etapas de:

(a) transformar una línea celular con una secuencia de polinucleótidos que comprende (i) una secuencia que codifica la proteína terapéutica y tiene un índice de adaptación de codones que es igual o mayor que 0, 9, y (ii) una secuencia que codifica un marcador de selección que es capaz de proporcionar la amplificación de la secuencia de polinucleótidos;

(b) proporcionar al menos una ronda de amplificación en presencia de un agente de selección; y

(c) seleccionar la línea celular una vez que se alcanza la meseta de la producción de la proteína

terapéutica; en el que la concentración del agente de selección y amplificación es 50% o menos de la concentración requerida para alcanzar un rendimiento de producción equivalente, en comparación con una secuencia que codifica la proteína terapéutica y tiene un índice de adaptación codón que es menor que 0, 9.

20. El procedimiento de la reivindicación 19, en el que:

(a) el agente de selección y amplificación es MSX o MTX; y/o (b) se requiere una ronda de amplificación para alcanzar el rendimiento de la producción equivalente.

FIGURA 3 FIGURA 4. FIGURA 5 FIGURA 6 FIGURA 7 FIGURA 8 FIGURA 9