Procedimiento de preparación de cultivos bacterianos probióticos analérgicos y uso relacionado.

Un procedimiento de preparación de cultivos bacterianos probióticos analérgicos,

caracterizado porque incluye al menos una etapa en la que las bacterias están en contacto con un medio de cultivo analérgico.

Procedimiento de preparación de cultivos bacterianos probióticos analérgicos y uso relacionado El objetivo de la presente invención, es un procedimiento para la preparación de cultivos bacterianos probióticos analérgicos.

Se sabe que el tracto gastrointestinal (GI) humano contiene una comunidad microbiana compleja, llamada microbiota, que consta principalmente de bacterias estrictamente anaerobias capaces de desempeñar diferentes acciones con efectos que afectan a nivel gastrointestinal local e indirectamente a nivel sistémico general, que implican casi todos los órganos y las funciones del huésped.

La microflora intestinal, que consta de una gran diversidad de diferentes especies (400-500) capaces de colonizar tanto la mucosa intestinal como las partículas de alimento ingerido, es entonces capaz de condicionar en gran medida la salud del individuo.

La composición de la microflora intestinal puede alterarse por varios factores, tales como la edad, el estado fisiológico del individuo, la presencia de diferentes patologías, el estrés y por encima de todo la dieta.

Como consecuencia de factores negativos endógenos y exógenos, hay una disminución de las bacterias útiles (típicamente bacterias que pertenecen al grupo de las ácido lácticas en el intestino delgado y bifidobacterias en el intestino grueso) y un aumento de las enterobacterias, estreptococos y clostridios patógenos.

La administración de probióticos específicos a través de especialidades medicinales, productos dietéticos, productos integradores y por encima de todo el alimento (los llamados alimentos "funcionales" o "nutracéuticos") permite reequilibrar la microflora del huésped, restaurando una funcionalidad intestinal óptima.

El término "probiótico" se refiere habitualmente a microorganismos vivos, seleccionados entre la microflora intestinal de individuos sanos, que una vez administrados en cantidades oportunas y durante un tiempo adecuado, son capaces de colonizar, también en casos solamente temporales, los diferentes tractos del intestino y de conferir un efecto beneficioso a la salud del organismo huésped.

Pertenecen a los probióticos principalmente algunas especies de los géneros Lactobacillus, Bifidobacterium, Streptococcus, Pediococcus, Lactococcus, Propionibacterium, Leuconostoc y en menor medida, Saccharomyces, Bacillus y Enterococcus.

Entre los efectos saludables y beneficiosos, mostrados por ensayos clínicos rigurosos realizados en todo el mundo e inducidos en el consumidor por la ingesta de probióticos pueden mencionarse:

1. Estimulación del sistema inmune;

2. Inducción de efectos antimutagénicos y antigenotóxicos;

3. Acción antitumoral y antimetastásica que se refiere, por ejemplo, a:

- carcinoma de intestino grueso

-carcinoma de mama

- cáncer de vejiga

4. Mejora de la absorción de nutrientes;

5. Disminución de los síntomas de intolerancia a la lactosa;

6. Mejora de la motilidad intestinal debido a la disminución del pH y a la disminución del estreñimiento;

7. Disminución de la absorción de colesterol y grasas;

8. Actividades anti-diarréicas, anti-hipertensivas, anti-diabéticas que inhiben infecciones del sistema urogenital femenino;

9. Actividad de prevención de patologías geriátricas. Los probióticos para uso oral deben caracterizarse por los siguientes requisitos generales y funcionales: i) origen intestinal humano; de individuos en buen estado de salud; ii) bio-seguridad; no deben causar efectos secundarios especialmente en personas debilitadas o inmunodeprimidas; iii) resistencia y viabilidad; deben tener características de resistencia tales para ser capaces de sobrevivir al jugo

gástrico, las secreciones pancreáticas y biliares de modo que alcancen el íleo y el colon de forma intacta y aún perfectamente viables.

La competición que comienza entre los microorganismos probióticos y la microflora patógena solamente puede suceder si, una vez ingeridos, los microorganismos probióticos son capaces de alcanzar el tracto intestinal y por lo tanto de sobrevivir a la acidez gástrica y a la elevada concentración de las sales biliares. Generalmente, una vez han alcanzado el tracto intestinal, se dice que empiezan a través de mecanismos de adhesión que implican proteínas y/o carbohidratos con funcionalidades de adhesión específica a las vellosidades intestinales.

A nivel industrial, los probióticos se producen en forma de cultivos bacterianos liofilizados, concretamente se determina el crecimiento de las células en un medio apropiado (fermentación) y después, tras la concentración y purificación de la biomasa, se realiza la deshidratación de la misma por liofilización. Dicho procedimiento es necesario para permitir que las bacterias se reproduzcan por sí mismas en una cantidad adecuada (etapa fermentativa) y para conservarse a sí mismas durante un largo tiempo (etapa de liofilización) .

Para que el procedimiento fermentativo se realice satisfactoriamente y con rendimientos adecuados, es necesario proporcionar a las células fuentes de carbono y nitrógeno, oligoelementos y bioactivadores en cantidades oportunas.

Tradicionalmente, tratando las habitualmente llamadas bacterias "lácticas", los sustratos seleccionados usados como fuente de nitrógeno son suero, proteínas séricas de la leche, hidrolizados y peptonas de caseína, caseinatos, etc., mientras que como fuente de carbono, habitualmente se emplean lactosa y glucosa, ya que se pueden metabolizar fácilmente por casi todos los organismos vivos.

Los hidrolizados de proteínas se han usado como sustratos por ejemplo en los documentos WO 2006/073145; WO 2005/0010170; y US 2005/214270.

En los últimos años, también probablemente a causa de una dieta muy poco variada y demasiado rica en proteínas y lípidos, en países de Europa y países occidentales se ha registrado un sensible aumento de la cantidad de personas que padecen patologías de tipo alérgico.

Las reacciones inmunes de tipo IV o mediadas por IgE se llaman "alérgicas", durante las que, después de un primer contacto de sensibilización (que puede suceder en cualquier momento de la vida, también en un momento intrauterino) se producen IgE específicas con un mecanismo mediado por histamina.

Dichas reacciones también pueden estar causadas por dosis extremadamente reducidas de moléculas llamadas "alérgenos", con consecuencias clínicas que pueden cambiar desde simples reacciones cutáneas ligeras a choque anafiláctico y muerte.

Debido a la peligrosidad de estas sustancias para algunas personas, la Comunidad Europea ha adoptado una norma de modo que tiene que mostrarse claramente "el uso en la producción y la presencia en el alimento" en la etiqueta de alimentos que pertenecen a las siguientes clases (Anexo III bis del anterior mandamiento) (art. 6 sub. 10, mandamiento 2000/13/EC modificado por tanto por la instrucción 2003/89/EC) :

cereales que contienen gluten (es decir trigo, centeno, cebada, avena, escanda, kamut o sus cepas hibridadas) y productos derivados; crustáceos y productos basados en crustáceos; huevos y productos basados en huevos; pescado y productos basados en pescado; cacahuetes y productos basados en cacahuetes; soja y productos basados en soja; leche y productos basados en leche (incluyendo la lactosa) ; frutos con cáscara, es decir, almendras (Amigdalus communis L.) , avellanas (Cor y lus avellana) , nueces comunes (Juglans regia) , anacardos (Anacardium occidental) , pacanas [Car y a illinoiesis (Wangenh) K. Koch], nueces de Brasil (Bertholletia excelsa) , pistachos (Pistacia vera) , macadamias (Macadamia ternifolia) y productos derivados; apio y productos basados en apio; mostaza y productos basados en mostaza; semillas de sésamo y productos basados en semillas de sésamo; dióxido de azufre y sulfitos en concentraciones mayores de 10 mg/kg o 10 mg/l expresadas como SO2.

Como, típicamente para la producción de probióticos, se usan derivados de sustratos basados en leche (como fuente de nitrógeno) y glucosa (como fuente de carbono) , que se origina habitualmente a partir del almidón (también almidón de trigo) , los probióticos pueden considerarse peligrosos si se administran a sujetos particularmente sensibles, incluso si, como mucho, pudieran contener realmente solo pequeñas trazas de alérgenos (por lo tanto derivados de la leche y/o del gluten) .

En el caso de la leche, pueden distinguirse dos causas de reacción adversa a este alimento; la alergia a las proteínas de la leche de vaca (APLV) y la intolerancia a la lactosa.

La leche, junto con el huevo, es el alimento más alergénico; esta característica de la misma... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento de preparación de cultivos bacterianos probióticos analérgicos, caracterizado porque incluye al menos una etapa en la que las bacterias están en contacto con un medio de cultivo analérgico.

2. Un procedimiento para la preparación de un cultivo bacteriano probiótico analérgico de acuerdo con la 5 reivindicación 1, en el que en dicha al menos una etapa, las bacterias de dicho cultivo, seleccionadas entre el grupo que incluye los géneros Lactobacillus, Bifidobacterium, Streptococcus, Pediococcus, Lactococcus, Propionibacterium, Bacillus, Saccharomyces, Enterococcus, Leuconostoc, se producen a través de un desarrollo en un sustrato analérgico.

3. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 2, en el que las bacterias de dicho cultivo se seleccionan 10 entre el grupo que comprende las siguientes especies bacterianas: L. pentosus, L. plantarum, L. casei, L. casei ssp. paracasei, L. casei ssp. rhamnosus, L. acidophilus, L. delbrueckii ssp. bulgaricus, L. fermentum, L. gasseri, B. longum. B. breve, B. lactis, B. adolescentis y B. pseudocatenulatum, L. lactis y L. Lactis ssp. lactis, S. thermophilus.

4. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones desde 1 hasta 3, en el que dichas bacterias se seleccionan entre el grupo que incluye las siguientes cepas bacterianas probióticas:

1 Streptococcus thermophilus LMG P-18383

2 Streptococcus thermophilus LMG P-18384

3 Lactobacillus pentosus LMG P-21019

4 Lactobacillus plantarum LMG P-21020

5 Lactobacillus plantarum LMG P-21021

6 Lactobacillus plantarum LMG P-21022

7 Lactobacillus plantarum LMG P-21023

8 Lactobacillus casei ssp. paracasei LMG P-21380

9 Lactobacillus acidophilus LMG P-21381

10 Bifidobacterium longum LMG P-21382

11 Bifidobacterium breve LMG P-21383

12 Bifidobacterium lactis LMG P-21384

13 Lactobacillus plantarum LMG P-21385

14 Lactococcus lactis ssp. lactis LMG P-21387

15 Lactococcus lactis ssp. lactis LMG P-21388

16 Lactobacillus plantarum LMG P-21389

17 Streptococcus thermophilus DSM 16506

18 Streptococcus thermophilus DSM 16507

19 Bifidobacterium longum DSM 16603

20 Bifidobacterium breve DSM 16604

21 Lactobacillus casei ssp. rhamnosus DSM 16605

22 Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus DSM 16606

23 Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus DSM 16607

24 Streptococcus thermophilus DSM 16590

25 Streptococcus thermophilus DSM 16591

(continuación)

26 Streptococcus thermophilus DSM 16592

27 Streptococcus thermophilus DSM 16593

28 Bifidobacterium adolescentis DSM 16594

29 Bifidobacterium adolescentis DSM 16595

30 Bifidobacterium breve DSM 16596

31 Bifidobacterium pseudocatenulatum DSM 16597

32 Bifidobacterium pseudocatenulatum DSM 16598

33 Staphylococcus xylosus DSM 17102

34 Bifidobacterium adolescentis DSM 17103

35 Lactobacillus plantarum DSM 17104

36 Streptococcus thermophilus DSM 17843

37 Streptococcus thermophilus DSM 17844

38 Streptococcus thermophilus DSM 17845

39 Lactobacillus fermentum DSM 18295

40 Lactobacillus fermentum DSM 18296

41 Lactobacillus fermentum DSM 18297

42 Lactobacillus fermentum DSM 18298

43 Lactobacillus gasseri DSM 18299

44 Lactobacillus gasseri DSM 18300

45 Lactobacillus gasseri DSM 18301

46 Lactobacillus gasseri DSM 18302

47 Bifidobacterium adolescentis DSM 18350

48 Bifidobacterium adolescentis DSM 18351

49 Bifidobacterium adolescentis DSM 18352

50 Bifidobacterium catenulatum DSM 18353

5. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 4, en el que el medio de cultivo analérgico incluye al menos una peptona y/o un hidrolizado proteico.

6. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 5, en el que la peptona y/o el hidrolizado proteico se seleccionan entre el grupo que incluye peptona y/o hidrolizado proteico de origen vegetal y/o animal; preferiblemente 5 dicha peptona de origen vegetal se selecciona entre el grupo que incluye: arroz, patata, maíz, castañas, tapioca, mandioca, guisante, habas, legumbres y/o sus mezclas; y dicha peptona de origen animal se selecciona entre las peptonas de carne.

7. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque ello comprende al menos una etapa en la que las bacterias se producen con un sustrato de cultivo analérgico sometido 10 previamente a un pretratamiento enzimático con el fin de eliminar trazas de alérgenos, si hubiera alguna, que existan por contaminación cruzada o no intencionada.

8. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 7, en el que el pretratamiento enzimático prevé el uso de al menos una enzima proteolítica y/o al menos una enzima glucosidasa, preferiblemente dicha enzima proteolítica se selecciona entre el grupo que incluye: proteasas y/o peptidasas; preferiblemente dichas proteasas y/o peptidasas se seleccionan del grupo que incluye tripsina, quimiotripsina, pancreatina, pepsina, papaína y bromelaína.

9. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 8, en el que la enzima glucosidasa se selecciona entre el grupo que incluye: alfa-glucosidasa y beta-glucosidasa, alfa-galactosidasa y beta-galactosidasa.

10. El procedimiento de acuerdo con una o más de las reivindicaciones 7 a 9, en el que el pretratamiento 5 enzimático incluye el uso de al menos una proteasa y al menos una glucosidasa.

11. El procedimiento de acuerdo con una o más de las reivindicaciones 7 a 10, en el que en el pretratamiento enzimático la proteasa se selecciona entre alcalasa y bromelaína y la glucosidasa se selecciona entre lactasa o beta-galactosidasa.

12. El uso de acuerdo con una o más de las reivindicaciones 7 a 11, en el que al final del pre-tratamiento

enzimático, se prevén una etapa en la que se restaura el pH a valores adecuados para la fermentación de las cepas individuales, una etapa de tratamiento con calor a una temperatura incluida entre 90 ºC y 145 ºC para desnaturalizar e inactivar las enzimas usadas en dicho pre-tratamiento enzimático y una etapa de fermentación de dichas cepas seleccionadas entre las descritas en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

13. Un cultivo bacteriano probiótico analérgico en el pre-tratamiento enzimático obtenible por el procedimiento 15 de acuerdo con de las reivindicaciones 1 a 12, que contiene:

i) una cantidad menor de 3 ppm de gluten, según se determina por el kit ELISA RIDASCREEN® Gliadin,

ii) una cantidad menor de 7 ppm de lactosa, según se determina por análisis con kit quimioenzimático y detección de ultravioleta-visible para la lactosa del tipo kit de “Lactosa/D-glucosa”,

iii) una cantidad de menos de 0, 05 ppm de º-lactoglobulina según se determina por el kit específico para la º20 lactoglobulina del tipo kit de cuantificación ELISA de º-lactoglobulinas bovina.

14. Uso de al menos un cultivo bacteriano probiótico analérgico de acuerdo con la reivindicación 13 para la preparación de un producto alimentario o de una formulación farmacéutica deseada para personas particularmente sensibles a sustancias alérgenas del tipo de gluten o del tipo lácteo.