Procedimiento de preparación de concentrado de inmunoglobulinas G (IgG) empobrecido en anticuerpos anti-A y anti-B.

Procedimiento de obtención de un concentrado de IgG, que comprende las etapas de:

A) preparación de un concentrado de IgG por fraccionamiento etanólico y/o por separación cromatográfica, asociando una etapa de inactivación vírica,

B) cromatografía de inmunoafinidad por percolación de dicho concentrado de IgG en una mezcla de medios cuyas matrices se injertan con los grupos N-acetilgalactosamina (GalNAc) - Galactosa (Gal) - Fucosa (Fuc) y Galactosa-Galactosa-Fucosa correspondientes a los epítopos de los grupos sanguíneos A y B, y

C) filtración de eliminación de virus y/o de partículas de tamaño superior a 20 nm.

Procedimiento de preparación de concentrado de inmunoglobulinas G (IgG) empobrecido en anticuerpos anti-A y anti-B.

[1] La presente invención se refiere a un procedimiento de obtención de un concentrado de IgG.

[2] La utilización de fracciones de plasma humano enriquecidas en inmunoglobulinas (Ig) para el tratamiento de diversas infecciones diversas o déficits congénitos se conoce desde el desarrollo del procedimiento de precipitación etanólica de Cohn (Cohn y col. 1946, J. Am. Chem. Soc. 68, 459; Oncley y col. 1949, J. Am. Chem. Soc. 71, 541).

[3] Existe, con este fin, una necesidad creciente de producir concentrados de Ig altamente purificados, inyectables por vía intravenosa (IglV), a partir, por ejemplo, de plasmas humanos. La complejidad de la estructura de las inmunoglobulinas (cuatro cadenas polipeptídicas unidas por puentes disulfuro), y la diversidad de anticuerpos presentes en la mezcla plasmática de varios miles de donantes, son factores que actualmente no favorecen el desarrollo biotecnológico de las inmunoglobulinas. Aunque se producen anticuerpos monoclonales por ingeniería genética, su extrema especificidad constituye un inconveniente para las aplicaciones terapéuticas en las que parece necesaria una poliespecificidad.

[4] Además, numerosas patologías, por ejemplo de origen autoinmune, se tratan actualmente con concentrados de IgG, lo que conduce a una situación de escasez en Europa y en Estados Unidos en los últimos años.

[5] Los procedimientos de obtención de inmunoglobulinas, y particularmente de concentrados de IgG, también pueden comprender, además de la precipitación selectiva de las proteínas por etanol, diversos tratamientos diferentes, tales como precipitación por polietilenglicol, tratamiento controlado por enzimas proteolíticas..., destinados a eliminar los agregados de polímeros de inmunoglobulinas susceptibles de activar el sistema del complemento con riesgos asociados de reacciones anafilácticas. Por otro lado, la presencia de dímeros en las IgGIV se ha relacionado con caídas de la tensión arterial in vivo (BleekerW.K. y col., Blood, 95, 2, pág. 1856-1861).

[6] Una vía alternativa a la precipitación por etanol se ha descrito por Steinbuch y col. (Rev. Frang. Y. Clin. Y Biol. 1969, XIV, 154) que recurren a la precipitación por ácido octanoico. Este ácido precipita la inmensa mayoría de las proteínas del plasma y deja las inmunoglobulinas en el sobrenadante. La purificación de estas inmunoglobulinas se realiza pasando a través de un intercambiador de aniones, DEAE-celulosa, en condiciones que no retienen las IgG. Después, la fracción de IgG no retenidas se concentra.

[7] Se han desarrollado también diversos procedimientos para aumentar la pureza de los productos por la aplicación de técnicas cromatográficas. Podemos citar particularmente las solicitudes de patente EP 73 922 y WO 99/64462, que describen la asociación de al menos dos etapas sucesivas de cromatografía, una por intercambio aniónico, la otra por intercambio catiónico. La especificidad de estos procedimientos se proporciona por la propiedad de los intercambiadores aniónicos de no retener las inmunoglobulinas G, en las condiciones de cromatografía convencionales, pero en su lugar fijan la mayor parte de las demás proteínas co-purificadas en el transcurso de las etapas de prepurificación. De forma análoga, se puede citar la solicitud de patente WO 2/92632, presentada por el Solicitante, que divulga la preparación de concentrados de Ig usando una única etapa de cromatografía en intercambiador aniónico, realizada a un pH alcalino, para su retención en el medio cromatográfico.

[8] Los documentos MAZID MAY COL.: "An improved affinity support and immunoadsorbent with a synthetic blood group oligosacárido and polimer coating for hemoperfusion". JOURNAL OF APPLIED BIOMATERIALS: SPRING 1992, vol. 3, N° 1, abril de 1992 y HOUT M S Y COL.: "Specific removal of anti-A and anti-B antibodies by using modified dialysis f i Itere". ASAIO JOURNAL (AMERICAN SOCIETY FOR ARTIFICIAL INTERNAL ORGANS: 1992) NOV-DIC 2, vol. 46, N° 6, noviembre de 2 (2-11), páginas 72-76, describen procedimientos que pretenden eliminar los anti-A y anti-B de un paciente antes de un trasplante y no describen de ninguna manera la preparación de un concentrado de IVIG desprovisto de anti-A y de anti-B.

[9] El documento KNEZEVIC-MARAMICA IRINA Y COL.: "Intravenous inmune globulins: an update for clinicians". TRANSFUSIÓN. OCT 23, vol. 43, N° 1, octubre de 23 (23-1), páginas 146-148, establece una revisión de las diferentes ventajas, inconvenientes y las indicaciones terapéuticas que caracterizan las IVIG. D4 divulga particularmente que las IVIG distribuidas en el mercado contienen niveles que pueden medirse de anticuerpos anti-A y anti-B y que estos anticuerpos pueden implicar la lisis de los hematíes del receptor.

[1] El documento NICHOLLS M D Y COL.: "HEMOLYSIS INDUCED BY INTRAVENOUSLY-ADMINISTERED IMMUNOGLOBULIN" MEDICAL JOURNAL OF AUSTRALIA, vol. 15, N° 7, 1989, páginas 44-46, aborda la hemolisis inducida por las inmunoglobulinas administradas por vía intravenosa.

[11] El documento W1/5851 describe un medio de tipo Sepharose 4FF en el que se fijan los trisacáridos correspondientes a los epítopos de los grupos sanguíneos A y B.

[12] Sin embargo, numerosas publicaciones científicas indican que la inyección de IgG obtenidas por las técnicas de fraccionamiento anteriores puede causar una hemolisis accidental, a veces grave, entre los pacientes en tratamiento. En calidad de ejemplo, pueden citarse las publicaciones de Buchta C. y col., Biologicals, 33, 25, 41- 48, Wilson J.R. y col., Muscle & Nervi, 29 (9), 1997, 1142-1145, Copelan E.Ay col., Transfusión, 26, 1986, 41-412, y Misbah S.A y col., Drug Safety, 9, 1993, 254-262. El estudio de los efectos sobre la sangre de los pacientes que presentaban una hemolisis, realizado particularmente usando la prueba de Coombs directa (DCT), mostró que los hematíes están revestidos de inmunoglobulinas dirigidas contra los antígenos A, B o D presentes en su superficie, provocando así su hemolisis. Por esta razón las IgG disponibles en el mercado se obtienen a partir de plasmas seleccionados para evitar la presencia de inmunoglobulinas anti-D u otros anticuerpos con títulos elevados de anti-A o anti-B.

[13] Buchta C. y col., que se ha citado anteriormente, consideraron diferentes enfoques para reducir de modo significativo los anticuerpos anti-A, que provenían de donantes de grupos sanguíneos B y O, y anti-B, que provenían de donantes de grupos sanguíneos A y O, en los derivados de plasma, tales como las IgG, para minimizar así los riesgos de hemolisis, directamente asociados a los niveles de estos anticuerpos, en el momento del tratamiento de los pacientes con estos derivados plasmáticos. Particularmente, se prevé escoger a los donantes, eliminar los anticuerpos anti-A y anti-B, producir derivados de plasma sanguíneo con origen en un grupo específico, grupo A y/o B, y excluir de los lotes los plasmas que tienen un título elevado de anticuerpos anti-A o anti-B. Algunos enfoques están considerados como no realistas debido al coste o de la complejidad de las etapas que hay que tomar. Se aprecia que los anticuerpos anti-A y anti-B se eliminan parcialmente en el transcurso del fraccionamiento etanólico que se ha mencionado anteriormente.

[14] Dado que las necesidades de IgG están en constante aumento, es necesario disponer de agrupamientos de donantes cada vez mayores que, estadísticamente, incluirán mayor número de donantes del grupo O. En consecuencia, los derivados sanguíneos, tales como las IgG, contendrán cantidades de anticuerpos anti-A y anti-B demasiado elevadas para eliminarse por fraccionamiento convencional.

[15] Estas necesidades crecientes no hacen tampoco factible seleccionar, por ejemplo, únicamente los donantes de grupo AB, para asegurarse un bajo contenido en anticuerpos anti-A y anti-B.

[16] Cada lote de concentrados o preparaciones de IgG purificadas se controla frente a anticuerpos anti-A y anti-B según la prueba de la Farmacopea Europea 2.6.2 (1997), que es una aplicación in vitro de la prueba de Coombs indirecta (ICT). El ensayo ICT consiste en añadir a una suspensión de hematíes, revestidos con anticuerpos anti-A o anti-B de tipo IgG contenidos en los concentrados de IgG, una solución de anticuerpos (antiglobulinas) dirigida contra motivos de las IgG humanas. Estos anticuerpos se unen a anticuerpos anti-A o anti-B fijados a los hematíes y causan así su aglutinación a través de la formación de puentes entre las IgG. El ensayo para la detección de anticuerpos anti-A o anti-B se inspira directamente por esta prueba convencional en la serología hematológica (prueba de Coombs).

1. Procedimiento de obtención de un concentrado de IgG, que comprende las etapas de:

A) preparación de un concentrado de IgG por fraccionamiento etanólico y/o por separación cromatográfica, asociando una etapa de inactivación vírica,

B) cromatografía de inmunoafinidad por percolación de dicho concentrado de IgG en una mezcla de medios cuyas matrices se injertan con los grupos N-acetilgalactosamina (GalNAc) - Galactosa (Gal) - Fucosa (Fue) y Galactosa-Galactosa-Fucosa correspondientes a los epítopos de los grupos sanguíneos A y B, y

C) filtración de eliminación de virus y/o de partículas de tamaño superior a 2 nm.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la etapa a) del procedimiento de la invención comprende una purificación previa por precipitación de contaminantes lipidíeos a partir de un plasma sanguíneo o a partir de una fracción de plasma sanguíneo enriquecida con IgG, cromatografía sencilla en una resina de intercambio aniónico realizada a pH alcalino y una elución selectiva de las IgG en una etapa usando un tampón adecuado de pH entre 4 y

7.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, en el que la etapa de inactivación vírica se realiza con un disolvente- detergente.

4. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la mezcla de soportes injertados con grupos que tienen una similitud antigénica con el grupo sanguíneo A y el grupo sanguíneo B tiene una proporción respectiva comprendida entre 25/75 y 75/25 (v/v), preferentemente 5/5 (v/v) en cada uno de los dichos soportes.

5. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende las etapas de concentración por ultrafiltración y de filtración por esterilización.

6. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la filtración de eliminación de los virus se realiza por nanofiltración.

7. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende, después de la etapa c), una etapa para añadir estabilizantes para la conservación de dicho concentrado de IgG.