Polipéptidos PUfH meningocócicos.

Un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácido SEQ ID NO: 23

Campo técnico

La invención está en el campo de inmunización y, en particular, inmunización contra enfermedades causadas por bacterias patogénicas en el género Neisseria, tales como N. meningitidis (meningococo).

Técnica anterior

Neisseria meningitidis es una bacteria Gram negativa encapsulada que coloniza el tracto respiratorio superior de aproximadamente 1% de la población humana. Aunque las vacunas de polisacárido y conjugados están disponibles contra los serogrupos A, C, W135 e Y, esta técnica no puede aplicarse al serogrupo B porque el polisacárido capsular es un polímero de ácido polisiálico, que es una autoantígeno en humanos. Para desarrollar una vacuna contra el serogrupo B, se han usado proteínas expuestas a la superficie contenidas en las vesículas de membrana externa (VME). Estas vacunas obtienen respuestas de anticuerpo bactericida del suero y protegen contra la enfermedad, pero fallan al Inducir protección de cepa cruzada [1]. Por lo tanto, algunos trabajadores se están centrando en antígenos meningocócicos específicos para su uso en vacunas [2],

Tal antígenos es la proteínas de unión al factor H (PUfH) meningocócica, también conocida como proteína 741, [SEQ IDs 2535 & 2536 en ref. 3; SEQ ID 1 aquí], NMB187 [refs. 4-6, siguiente ref. 2], P286, LP286 u ORF286 [7-9], Esta lipoproteína se expresa en todos los grupos meningocócicos y se ha encontrado en múltiples cepas menlngocócicas. Las secuencias de PUfH se han agrupado en tres familias [4] (aquí referidas como familias I, II y III), y se ha descubierto que el suero provocadso contra una familia dada es bactericida en la misma familia, pero no es activo contra cepas que expresan una de las otras dos familias, esto es, hay una protección cruzada intra- familiar, pero no hay protección cruzada inter-familiar.

Para conseguir protección de cepa cruzada usando PUfH, por lo tanto, puede usarse más de una familia. Para evitar la necesidad de expresar y purificar proteínas separadas, se ha propuesto expresar diferentes familias como proteínas híbridas [1-12], Incluyendo dos o tres de las familias en una única cadena polipeptídica. Las referencias 13 y 14 describen varias técnicas basadas en mutagénesis para modificar secuencias de PUfH para aumentar su cobertura en las familias I, II y III.

Es un objeto de la invención proporcionar técnicas adicionales y mejoradas para superar la especificidad familiar de protección ofrecida por PUfH, y usar estas técnicas para proporcionar inmunidad contra enfermedad y/o infección meningocócica, particularmente para serogrupo B.

Divulgación de la invención

PUfH de longitud completa tiene la siguiente secuencia de aminoácido (SEQ ID NO: 1) en cepa MC58:

MNRTAFCCLSLTTALILTACSSGGGGVAADIGAG1ADAI.TAPLDHKDKGLQSLTLDQSVRKNEKLK

LAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQVYKQSHSALTAFQTEQ

IQDSEHSGKMVAKRQFRÍGDIAGEHTSFDKLPEGGRATyRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGNG

KIEHLKSPELNVDLAAADIKPDGKRHAVISGSVLYNQAEKGSYSLGIFGGKAQEVAGSAEVKTVNG

IRHIGLAAKQ

La lipoproteínas madura carece de los primeros 19 aminoácidos de SEQ ID NO: 1, y la forma AG de PUfH carece de los primeros 26 aminoácidos.

La secuencia MC58 (SEQ ID NO: 1) es una familia PUfH. Los anticuerpos obtenidos usando la secuencia MC58 tienen una alta actividad bactericida contra la cepa MC58, pero tienen una actividad mucho más baja contra cepas que expresan una familia I o II PUfH. En algunas realizaciones la invención se refiere a formas modificadas de PUfH, donde la modificación o las modificaciones mejorar la habilidad de la proteína para obtener anticuerpos bactericidas de familia cruzada. En otras realizaciones la invención se refiere a formas de PUfH que de manera natural obtienen anticuerpos bactericida de familia cruzada.

Así, la invención proporciona un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácido. Esta secuencia de aminoácido comienza en el residuo que corresponde a Val-27 de la secuencia MC58 pero incluye varias modificaciones de aminoácido en los sitios corriente abajo.

Los polipéptidos tienen la habilidad de incluir anticuerpos bactericidas anti-meningocócicos después de su administración a un animal huésped, y es realizaciones preferentes pueden inducir anticuerpos que son bactericidas

contra cepas en cada una de las tres familias I a III de PUfH. Más abajo se da más información sobre respuestas bactericidas.

Polipéptidos

Los polipéptidos de la invención pueden preparase mediante varios medios, por ejemplo, mediante síntesis química (al menos en parte), digiriendo polipéptidos más largos usando proteasas, mediante traslación de ARN, mediante purificación de cultivo celular (por ejemplo, de expresión recombinante o de cultivo de N. menigitidis), etc. La expresión heteróloga en un huésped E. coli es una ruta preferente de expresión.

PUfH es naturalmente una proteína en N. meningitidis. También se ha descubierto que se convierte en lípico cuando se expresa en E. coli con su secuencia líder nativa. Los polipéptidos de la invención pueden tener un residuo de cisteína en terminal N, que puede convertirse en lípido, por ejemplo, comprendiendo un grupo palmitoilo, normalmente formando una tripalmitoilo-S-gliceril-cisteína. En otras realizaciones los polipéptidos no se convierten en lípidos.

Una característica de polipéptidos preferentes de la invención es la habilidad para inducir anticuerpos bactericidas anti-meningocócicos después de su administración a un animal huésped.

Los polipéptidos se preparan preferentemente en forma sustancialmente pura o en forma sustancialmente aislada (esto es, sustancialmente libres de otros polipéptidos de Neisseria o de célula huésped) o en forma sustancialmente aislada. En general, los polipéptidos se proporcionan en un medio que ocurre de manera no natural, por ejemplo, se separan de su medio que ocurre de manera natural, en ciertas realizaciones, el polipéptido sujeto está presente en una composición que está enriquecida para el polipéptido en comparación con un control. Así, se proporciona un polipéptido purificado, y por purificado se entiende que el polipéptido está presente en una composición que está sustancialmente libre de otros polipéptidos expresados, donde por sustancialmente libre se entiende que menos del 9%, normalmente menos del 6% y más normalmente menos del 5% de la composición está formada por otros polipéptidos expresados.

Los polipéptido pueden tomar varias formas (por ejemplo, nativos, fusiones, glicosilados, no glicosilados, convertidos en lípidos, puentes de disulfuro, etc.).

Las SEQ ID Nos 4 a 76 no incluyen metionina de terminal N. Si un polipéptido de la invención se produce mediante traslación en un huésped biológico entonces se requiere un codón de inicio, que proporcionará una metionina de terminal N en la mayoría de los huéspedes. Así, un polipéptido de la invención incluirá, al menos en una fase naciente, un residuo de metionina corriente arriba de dicha secuencia SEQ ID NO.

En algunas realizaciones el polipéptido tiene una única metionina en la terminal N inmediatamente seguida por la secuencia SEQ ID NO; en otras realizaciones puede usarse una secuencia corriente arriba más larga. Tal secuencia corriente arriba puede ser corta (por ejemplo, 4 o menos aminoácidos, esto es, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 3, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 2, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 1, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1). Ejemplos incluyen secuencias líderes para dirigir proteínas circulantes, o secuencias peptídicas cortas que facilitan la clonación o purificación (Por ejemplo, etiquetas de histidina, esto es, Hisn donde n = 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 1 o más). Otras secuencias de aminoácido de terminal N adecuadas serán aparentes para aquellos expertos en la técnica.

Un polipéptido de la invención también puede incluir aminoácidos corriente abajo del aminoácido final de las secuencias SEQ ID NO. Tales extensiones pueden ser cortas (por ejemplo, 4 o menos aminoácidos, esto es, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 3, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 2, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 1, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1). Ejemplos incluyen secuencias líderes para dirigir proteínas circulantes, secuencias peptídicas cortas que facilitan la clonación o purificación (Por ejemplo, etiquetas de histidina, esto es, Hisn donde n = 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 1 o más), o secuencias que mejoran la estabilidad del polipéptido. Otras secuencias de aminoácido de terminal C adecuadas serán aparentes para aquellos expertos en la técnica.

El término polipéptido se refiere a polímeros de aminoácido de cualquier longitud. El polímero puede ser lineal o ramificado,... [Seguir leyendo]

1. Un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácido SEQ ID NO: 23

2. El polipéptido de la reivindicación 1, que comprende la SEQ ID NO: 8.

3. Ácido nucleico que codifica el polipéptido de cualquier reivindicación precedente.

4. Un plásmido que comprende una secuencia de nucleótido que codifica el polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2.

5. Una célula huésped transformada con el plásmido de la reivindicación 4.

6. La célula huésped de la reivindicación 5, donde la célula es una bacteria meningocócica.

7. Vesículas de membrana preparadas a partir de la célula huésped de la reivindicación 6, donde las vesículas Incluyen un polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2.

8. Una composición inmunogénica que comprende un polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2 o una vesícula de la reivindicación 7.

9. La composición de la reivindicación 8, que Incluye un adyuvante.

1. La composición de la reivindicación 9, donde el adyuvante comprende una sal de aluminio.

11. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 8 a 1, que además comprende un segundo polipéptido que, cuando se administra a un mamífero, obtiene una respuesta de anticuerpo que es bactericida contra menlngococo, siempre y cuando el segundo polipéptido no sea una PufH meningocócica.

12. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, que además comprende un sacárido capsular conjugado de N. meningitidis serogrupo A, C, W135 y/o Y.

13. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12, que además comprende un sacárido capsular conjugado neumocócico.

14. El polipéptido de la reivindicación 1 o reivindicación 2, o las vesículas de la reivindicación 7, para su uso como un medicamento, por ejemplo para prevenir infección meningocócica en un mamífero.