Polipéptido termoestable con actividad esterasa, variantes del mismo y sus aplicaciones.

Polipéptido termoestable con actividad esterasa, variantes del mismo y sus aplicaciones.

Se describe un polipéptido termoestable con actividad esterasa basado en la esterasa I de Pseudomonas fluorescens (PFEI) y sus aplicaciones.

Polipéptido termoestable con actividad esterasa, variantes del mismo y sus aplicaciones

CAMPO TECNICO DE LA INVENCION

La presente invención se refiere a un polipéptido termoestable con actividad esterasa, variantes del mismo y a sus aplicaciones.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION

Las esterasas son enzimas empleadas como biocatalizadores en procesos industriales por las ventajas que confieren sobre la química tradicional, entre las que se encuentran una elevada regio-y estéreo-selectividad; además, permiten trabajar en condiciones de reacción más suaves, lo que implica una menor dependencia del empleo de disolventes o reactivos contaminantes y la reducción de los pasos necesarios para completar la transformación de un sustrato en productos de reacción. El interés de la industria biotecnológica en estas enzimas reside, además, en que no requieren cofactores para llevar a cabo su actividad catalítica.

Las esterasas se clasifican en varias subclases según el enlace sobre el que actúan (éster peptídico, amida) . Las éster hidrolasas (EC 3.1) , comúnmente denominadas esterasas, representan un grupo diverso de hidrolasas que catalizan la ruptura y formación de enlaces tipo éster. Estas enzimas están ampliamente distribuidas en animales, plantas, insectos y microorganismos mesófilos y termófilos, y constituyen una familia de enzimas con un amplio rango de sustratos; de ahí que su potencial hidrolítico pueda extenderse a cualquier compuesto que contenga un enlace éster. De acuerdo con la naturaleza del enlace éster sobre el que actúan, las éster hidrolasas han sido subdivididas en: carboxil éster hidrolasas (EC 3.1.1) , tioéster hidrolasas (EC 3.1.2) , fosfomonoesterasas (EC 3.1.3) y fosfodiesterasas (EC 3.1.4) . Las carboxil éster hidrolasas (EC 3.1.1) , se dividen en dos subclases principales en base a la especificidad de sustrato: carboxil esterasas (EC 3.1.1.1) o esterasas verdaderas y las lipasas (EC 3.1.1.3) . Las carboxil esterasas por tanto, constituyen un grupo amplio de enzimas capaces de metabolizar una gran variedad de sustratos mediante la hidrólisis de enlaces éster en presencia de agua obteniéndose un alcohol y un ácido carboxílico como productos de reacción. Dichas enzimas (y las lipasas) se clasifican además como Q, º hidrolasas debido a que presentan un plegamiento constituido por 8 láminas º, rodeadas por hélices Q.

A través de un mecanismo similar al mecanismo de acción de las serin- proteasas, las carboxil esterasas pueden transferir grupos acilo a nucleófilos, como por ejemplo grupos carbonilo, o bien disociar hidrolíticamente enlaces éster. La mayor parte de las esterasas, lipasas y serin-proteasas comparten la triada catalítica, un motivo de secuencia que consiste en los aminoácidos serina (S) , histidina (H) y ácido aspártico (D) , en donde el átomo de carbono de carbonilo es sometido a un ataque nucleofílico por el residuo de serina activo que conlleva la ruptura del enlace éster.

El uso de carboxil esterasas en la industria biotecnológica y farmacéutica es frecuente para obtener compuestos (alcoholes generalmente) ópticamente activos, ácidos o ésteres de cadenas de carbono cortas. Por ejemplo, la esterasa aislada de Bacillus subtilis se utiliza para la obtención de (R, S) -naproxeno y de (R, S) -ibuprofeno metiléster con una elevada pureza óptica, o la esterasa de Pseudomonas sp se utiliza para la síntesis de ibuprofeno. Además, las carboxil esterasas son utilizadas en la industria agrícola para la degradación de compuestos organosfosforados, o en la industria alimentaria para la liberación del ácido ferúlico de la pared polisacarídica de las plantas.

Los procesos de transformación biológica en los que se emplean las esterasas como biocatalizadores requieren generalmente el empleo de agentes desnaturalizantes y temperaturas elevadas durante periodos de tiempo prolongados. Las enzimas procedentes de organismos termófilos (aquellos que crecen a temperaturas superiores a 45ºC) , o termozimas, presentan un elevado grado de estabilidad natural a altas temperaturas. Sin embargo, pese a que dicha estabilidad sea ventajosa, es frecuente que las enzimas aisladas de organismos termófilos presenten muy baja actividad a temperaturas bajas o moderadas (por ejemplo, a temperatura ambiente) lo cual limita enormemente su aplicabilidad industrial.

La enzima con actividad (carboxil) esterasa aislada de Pseudomonas fluorescens, PFEI tiene un gran potencial biocatalítico y es utilizada en la industria química en la degradación de ésteres de cadena corta, tales como el acetato de de vinilo que es hidrolizado a ácido acético y acetaldehído. El empleo de dicha enzima en los procesos industriales biotecnológicos, químicos y farmacéuticos se ve, sin embargo, restringido debido a que dicha enzima presenta unas condiciones limitadas de estabilidad a temperaturas elevadas y en presencia de agentes desnaturalizantes. Mediante la modificación de la secuencia amonoacídica de PFEI empleando la técnica de ingeniería de proteínas, Jochens et al (Jochens et al, 2010 Protein Eng. Des. and Sel, 23 (12) : 903909) han conseguido una mejora en la estabilidad de PFEI en condiciones de temperaturas elevadas. Sin embargo, la aplicabilidad industrial de esta enzima con mayor termoestabilidad que la enzima silvestre sigue siendo limitada en aquellos procesos que requieren el empleo de temperaturas elevadas durante un periodo

prolongado de tiempo, así como el uso de agentes desnaturalizantes, tales como disolventes orgánicos, a los que dicha enzima es sensible.

Existe, por tanto, la necesidad de disponer de enzimas con actividad esterasa que sean estables a temperaturas elevadas durante periodos de tiempo prolongados y que conserven dicha actividad a temperaturas moderadas o bajas; ventajosamente, dichas enzimas deberían ser estables en presencia de agentes desestabilizantes, tales como disolventes orgánicos.

COMPENDIO DE LA INVENCION

Los autores de la presente invención han generado unas variantes termoestables de la esterasa I de P. fluorescens (PFEI) mediante mutagénesis al azar y selección en Thermus thermophilus que posteriormente han clonado y expresados en Escherichia coli bajo el control de un promotor inducible. Algunas variantes de PFEI han sido caracterizados bioquímicamente como proteínas con actividad esterasa altamente estables a temperaturas elevadas, con una temperatura óptima de reacción de 65ºC y una temperatura de desnaturalización superior a 90ºC, tal como se muestra en el Ejemplo 3. Por tanto, tales proteínas pueden actuar como esterasas termoestables.

Por tanto, en un aspecto, la invención se relaciona con un polipéptido con actividad esterasa que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1, y, al menos, una mutación puntual que consiste en la sustitución de un aminoácido presente en dicha secuencia por otro aminoácido, en donde dicha mutación presente en dicha secuencia SEQ ID NO: 1 se selecciona del grupo formado por:

(i) una mutación puntual en el aminoácido glutamina (Q) localizado en la posición 11 de SEQ ID NO: 1, en donde dicha glutamina es substituida por el aminoácido Leucina (L) [Q11L],

(ii) una mutación puntual en el aminoácido alanina (A) localizado en la posición 191 de SEQ ID NO: 1, en donde dicha alanina es substituida por el aminoácido serina (S) [A191S], y

(iii) una mutación puntual en el aminoácido ácido aspártico (D) localizado en la posición 212 de SEQ ID NO: 1, en donde dicho ácido aspártico es substituido por el aminoácido tirosina (Y) [D212Y],

(iv) y cualquier combinación de las mismas;

o una variante funcionalmente equivalente de dicho polipéptido.

En otro aspecto, la invención se relaciona con una proteína de fusión que comprende:

i) un polipéptido A que comprende un polipéptido proporcionado por la presente invención; y

ii) un polipéptido B, en donde dicho polipéptido B es un polipéptido diferente a dicho polipéptido A.

En otro aspecto, la invención se relaciona con una construcción génica que comprende un polinucleótido proporcionado por la presente invención.

En otro aspecto la invención se relaciona con un vector que comprende un polinucleótido o una construcción génica proporcionada por la presente invención.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un organismo que comprende un polinucleótido, una construcción génica, o un vector, proporcionados por la presente invención.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un procedimiento para obtener un polipéptido o una proteína de fusión proporcionados por la presente invención que comprende cultivar un organismo proporcionado por esta... [Seguir leyendo]

1. Un polipéptido con actividad esterasa, que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1, y, al menos, una mutación puntual que consiste en la sustitución de un aminoácido presente en dicha secuencia por otro aminoácido, en donde dicha mutación presente en dicha secuencia SEQ ID NO: 1 se selecciona del grupo formado por:

(i) una mutación puntual en el aminoácido glutamina (Q) localizado en la posición 11 de SEQ ID NO: 1, en donde dicha glutamina es substituida por el aminoácido Leucina (L) [Q11L],

(ii) una mutación puntual en el aminoácido alanina (A) localizado en la posición 191 de SEQ ID NO: 1, en donde dicha alanina es substituida por el aminoácido serina (S) [A191S], y

(iii) una mutación puntual en el aminoácido ácido aspártico (D) localizado en la posición 212 de SEQ ID NO: 1, en donde dicho ácido aspártico es substituido por el aminoácido tirosina (Y) [D212Y],

(iv) y cualquier combinación de las mismas;

o una variante funcionalmente equivalente de dicho polipéptido.

2. Polipéptido según la reivindicación 1, en donde dicho polipéptido es estable a una temperatura comprendida entre 60ºC y 95ºC.

3. Polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en donde dicho polipéptido tiene una vida media de más de 33 minutos a 65ºC.

4. Polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicho polipéptido tiene una temperatura de desnaturalización (Tm) mayor de 71ºC, determinada en ausencia de un agente caotrópico.

5. Polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dicho polipéptido tiene una temperatura de desnaturalización (Tm) mayor de 71ºC, determinada en presencia de cloruro de guanidinio 62, 5 mM como un agente caotrópico.

6. Polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde dicho polipéptido es estable en un disolvente orgánico polar aprótico.

7. Polipéptido según la reivindicación 6, en donde dicho disolvente orgánico polar aprótico se seleccionan de un grupo formado por dimetilsulfóxido (DMSO) , dimetilformamida (DMF) , tetrahidrofurano (THF) y sus combinaciones.

8. Polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que cataliza la hidrólisis enzimática de un éster carboxílico contenido en un compuesto, o la hidrólisis enzimática de una lactona, o la hidrólisis enzimática de una lactama, o la obtención de un halogenuro orgánico.

9. Una proteína de fusión que comprende: i) un polipéptido A que comprende un polipéptido según cualquiera de las revindicaciones 1 a 8; y

ii) un polipéptido B, en donde dicho polipéptido B es un polipéptido diferente a dicho polipéptido A.

10. Proteína de fusión según la reivindicación 9, en donde dicho polipéptido B es un polipéptido útil para aislar y/o purificar proteínas.

11. Proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 9 ó 10, en donde dicho polipéptido B se selecciona del grupo formado por una cola de histidinas, una cola de argininas, FLAG-tag, Strep-tag, xmyc-tag, SBP-tag, S-tag, péptido de unión a calmodulina, dominio de unión a celulosa, dominio de unión a quitina, glutatión S-transferasa-tag, proteína de unión a maltosa, NusA, TrxA, DsbA, Avi-tag, galactosidasa y VSV-glicoproteína.

12. Un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 o una proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11.

13. Una construcción génica que comprende un polinucleótido según la reivindicación 12.

14. Un vector que comprende un polinucleótido según la reivindicación 12 o una construcción génica según la reivindicación 13.

15. Vector según la reivindicación 14 en el que dicho vector es un vector de expresión.

16. Un organismo que comprende un polinucleótido según la reivindicación 12, una construcción génica según la reivindicación 13, o un vector según la reivindicación 14 ó 15.

17. Organismo según la reivindicación 16, en el que dicho organismo es un organismo mesófilo.

18. Organismo según la reivindicación 17, en el que dicho organismo es una bacteria mesófila.

19. Un procedimiento para obtener un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o una proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, que comprende cultivar un organismo según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18, bajo condiciones que permiten la expresión de dicho polipéptido o proteína de fusión y si se desea, recuperar dicho polipéptido o proteína de fusión.

20. Un método para hidrolizar enzimáticamente un éster carboxílico presente en un compuesto que comprende poner en contacto dicho compuesto que contiene un éster carboxílico con un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o con una proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, bajo condiciones adecuadas para la hidrólisis de dicho éster carboxílico.

21. Método según la reivindicación 20, en el que dicho compuesto que tiene un grupo éster carboxílico es un compuesto de fórmula (I)

R1-COOR2

(I)

donde R1 y R2, independientemente entre sí, representan un radical de un compuesto orgánico que contiene al menos 1 átomo de carbono.

22. Método según la reivindicación 20, en el que dicho compuesto que tiene un grupo éster carboxílico es un acilglicerol de cadena corta.

23. Método según cualquiera de las reivindicaciones 20 a 22, en el que la hidrólisis enzimática se lleva a cabo a una temperatura comprendida entre 20ºC y 95ºC, opcionalmente en presencia de un agente caotrópico, y/o de un disolvente orgánico polar aprótico.

24. Método según cualquiera de las reivindicaciones 20 a 23, en el que la hidrólisis enzimática se lleva a cabo en presencia de peróxido de hidrógeno.

25. Un método para hidrolizar enzimáticamente una lactona que comprende poner en contacto dicha lactona con un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o con una proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, bajo condiciones adecuadas para la hidrólisis de dicha lactona.

26. Método según la reivindicación 25, en el que la hidrólisis enzimática se lleva a cabo a una temperatura comprendida entre 20ºC y 95ºC, opcionalmente en presencia de un agente caotrópico, y/o de un disolvente orgánico polar aprótico.

27. Un método para hidrolizar enzimáticamente una lactama que comprende poner en contacto dicha lactama con un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o con una proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, bajo condiciones adecuadas para la hidrólisis de dicha lactama.

28. Método según la reivindicación 27, en el que la hidrólisis enzimática se lleva a cabo a una temperatura comprendida entre 20ºC y 95ºC, opcionalmente en presencia de un agente caotrópico, y/o de un disolvente orgánico polar aprótico.

29. Un método para obtener enzimáticamente un halogenuro orgánico que comprende poner en contacto un compuesto orgánico con un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o con una proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en presencia de un haluro y de

peróxido de hidrógeno, o una fuente de peróxido, en un medio que comprende protones, bajo condiciones adecuadas para la producción de dicho halogenuro orgánico.

30. Método según la reivindicación 29, en el que dicha reacción enzimática se lleva a cabo a una temperatura comprendida entre 20ºC y 95ºC, opcionalmente en presencia de un agente caotrópico, y/o de un disolvente orgánico polar aprótico.

A

B

FIG. 1

B

A

D

E

FIG. 2

FIG. 3

A

B

FIG. 4

A

B

FIG. 5

FIG. 6

A

B

FIG. 7

FIG. 7 (cont.)

FIG. 8

FIG. 9

FIG. 10