Parvovirus modificado útil para silenciamiento génico.

Parvovirus de roedor para regular por disminución la expresión de un gen diana en una célula caracterizado porque contiene un ácido nucleico específico de diana que se inserta en una región no traducida en el sentido de 3' del gen de VP de parvovirus y puede expresarse bajo el control de un promotor o región promotora reconocible por una ARN polimerasa en la célula,

en el que dicho ácido nucleico específico de diana puede transcribirse en una iARN, y en el que dicho parvovirus puede replicarse y propagarse en la célula.

Parvovirus modificado útil para silenciamiento génico

La presente invención se refiere a una entidad para regular por disminución eficazmente la expresión de un gen de interés en una célula. Con este fin, la presente invención proporciona un parvovirus de roedor modificado, de replicación competente, para regular por disminución un gen diana caracterizado porque dicho parvovirus contiene un ácido nucleico especifico de diana expresable que puede transcribirse en una iARN. La presente invención también proporciona células u organismos que comprenden dicho parvovirus.

La interferencia por ARN (iARN) no sólo ha revolucionado el procedimiento de identificación y caracterización funcional de nuevos genes, sino que representa una opción terapéutica prometedora para tratar enfermedades humanas, en particular cáncer (1,2). El motivo de este éxito radica en la alta especificidad y eficacia de moléculas inductoras de iARN con respecto a genes diana que los tratamientos convencionales no pueden alcanzar. Los ARN pequeños tales como microARN (miARN) o ARN de interferencia pequeños (ARNip) tienen la capacidad de unirse a secuencias de ARNm complementarias desencadenando su degradación o bloqueando su traducción (1). Pueden diseñarse ARNip para silenciar la expresión de cualquier gen, expandiendo las posibilidades de intervención teóricamente a la totalidad del genoma. Para el cáncer, ya se ha demostrado que los ARNip (y miARN) son una herramienta poderosa en la regulación por disminución de la expresión de genes que controlan la señalización, proliferación, diferenciación, apoptosis y senescencia celulares (1, 2). Esta lista también incluye factores de transcripción que no pueden manipularse generalmente mediante enfoques convencionales. El silenciamiento eficaz de oncogenes mutados o genes antiapoptóticos tales como K-Ras, p53 mutado, c-myc, Her2/neu, bcl-2, bcr-ab1, survivina y E6 del virus del papiloma humano 16 que conduce a detención y/o apoptosis celular son sólo unos cuantos ejemplos del éxito de tal enfoque en la terapia contra el cáncer al nivel preclínico [para una revisión véanse (3) y (4)].

La ruta de iARN se encuentra en muchas eucariotas incluyendo animales y se inicia por la enzima Dicer, que escinde moléculas de ARN bicatenario (ARNbc) largas en fragmentos cortos de ~20 nucleótidos que se denominan ARNip. Cada ARNip está desenmallado en dos ARNmc monocatenarios, concretamente la hebra pasajera y la hebra guía. La hebra pasajera se degradará, y la hebra guía se incorpora en el complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC). El resultado mejor estudiado es el silenciamiento génico postranscripcional, que se produce cuando la hebra guía experimenta apareamiento de bases con una secuencia complementaria de una molécula de ARN mensajero e induce escisión por la proteína Argonauta, el componente catalítico del complejo RISC. En algunos organismos se sabe que este proceso se disemina de manera sistémica a pesar de las concentraciones molares limitadas inicialmente de ARNip.

A pesar de su gran potencial, deben superarse varios inconvenientes para introducir exitosamente terapias a base de iARN en la práctica clínica. Éstos incluyen la evitación de efectos inespecíficos no deseados, la activación de la inmunidad innata y la semivida corta de las moléculas de ARNip con potencial de inactivación diluidas en cada ronda de división celular (5). Sin embargo, el principal obstáculo sigue siendo la administración segura y eficaz de moléculas desencadenantes de iARN en las células diana que da como resultado escasa captación celular y acumulación no específica en tejidos (2, 5).

Los ARN en horquilla cortos (ARNhc) son otra clase de efectores de iARN (6). Los ARNhc se transcriben en el núcleo a partir de un vector de expresión que porta un casete de expresión de ARNhc compuesto habitualmente por un promotor de ARN polimerasa II (Pol II) o III (Pol III) y una secuencia de ADN bicatenario corta con un bucle en horquilla. El transcrito de ARNhc se exporta entonces al citoplasma y se procesa como cualquier ARNip (5, 6). Se sintetizan constantemente ARNhc en las células huésped, lo que conduce a un silenciamiento génico más duradero. Sin embargo, la administración intracelular de los vectores que expresan ARNhc a través de transfección es escasamente eficaz, lo que requiere nuevos modos de administración (6). Para este fin, se han dirigido numerosos estudios hacia el aprovechamiento de virus como vehículo de transferencia para ARNhc. Esto también está favorecido por el hecho de que los casetes de ARNhc son habitualmente de tamaño pequeño y pueden insertarse generalmente en cualquier genoma viral sin afectar a la capacidad de empaquetamiento del virus. Ejemplos de viriones modificados por ingeniería genética con este fin se basan en retrovirus, lentivirus, adenovirus, virus del herpes simple, virus vaccinia y poliovirus (7). Estos virus son normalmente patógenos humanos, por tanto se vuelven de replicación defectuosa a través de modificaciones genéticas de sus genomas. Esto hace que no puedan diseminarse a través del tumor. La incapacidad de propagarse también se encuentra para los virus adenoasociados (VAA) que se usan comúnmente en terapia génica y contra el cáncer y también se investigaron como candidatos para la administración de ARNhc (8, 9). También es importante mencionar que para muchos de los virus mencionados anteriormente, la exposición previa de seres humanos a infección viral que provoca anticuerpos neutralizantes protectores puede poner en peligro el tratamiento a base de virus (10).

Por ejemplo, se ha mostrado que es posible insertar un casete de ARNhc en un vector lentiviral y usar este vector para silenciamiento génico. Puesto que los lentivirus son patógenos humanos, se vuelven de replicación defectuosa a través de modificaciones genéticas de su genoma (24). Otro artículo describe un parvovirus Lulll con un promotor P4 modificado mediante ingeniería genética que expresa luciferasa. Puesto que el promotor P4 se ha modificado y

se expresa un transgén heterólogo mediante deleción de otras partes del genoma del parvovirus, este vector pierde su capacidad de replicarse (25).

Por tanto, el objeto de la presente invención es proporcionar medios para regular por disminución eficazmente la expresión de un gen deseado en una célula u organismo.

Según la Invención esto se consigue proporcionando la materia definida en las reivindicaciones. La presente invención describe el primer parvovirus autónomo que porta un casete de expresión de ARNhc (denominado H-1PV- silencer). Parvovirus de roedor tales como parvovirus de rata H-1PV y su homólogo de ratón virus diminuto del ratón (MVM) han atraído una gran atención por su potencial anticancerígeno dado que no son patógenos para seres humanos y tienen propiedades oncolftlcas y oncosupresoras (11). La inmunidad antlvlral preexistente no es habitualmente un problema para estos virus puesto que los seres humanos no se exponen normalmente a una infección por parvovirus de roedor. El genoma del parvovirus consiste en un ADN monocatenarlo de aproximadamente 5100 bases que contiene dos promotores, P4 y P38 que regulan la expresión de las proteínas no estructurales (NS1 y NS2) y de la cápslda (VP1 y VP2), respectivamente. La activación del promotor P4 es una etapa crítica en el ciclo vital de PV. La actividad del promotor P4 se modula más tarde mediante su propio producto génico NS1, pero su activación Inicial depende completamente de factores celulares del huésped, que se expresan principalmente durante la fase S del ciclo celular (12). Esta dependencia, junto con el hecho de que el virus no puede estimular la proliferación de células qulescentes, contribuye al oncotropismo del virus, que se replica preferentemente en células en proliferación, transformadas o malignas. Además, la cltotoxlcldad del parvovirus también se estimula por cambios celulares asociados con transformación neoplásica (11, 13). NS1 es la protelna tóxica viral principal (13). Se ha mostrado que H-1PV activa varias rutas de muerte en células cancerosas. En particular, dependiendo del tipo de célula y las condiciones de crecimiento, H-1PV puede Inducir apoptosls (14-16), necrosis (17) o muerte celular dependiente de catepslna B (18). Aunque el potencial antlcancerlgeno de los PV está respaldado por un gran conjunto de estudios precllnlcos, puede esperarse que la eficacia sea un factor limitante en aplicaciones clínicas. Es posible que algunas células cancerosas sobrevivan al tratamiento con virus, provocando recidiva tumoral. El simple hecho de que estos virus se han aislado de tumores en crecimiento, Indica que solos no siempre son lo suficientemente potentes como para detener el crecimiento o provocar... [Seguir leyendo]

Parvovirus de roedor para regular por disminución la expresión de un gen diana en una célula caracterizado porque contiene un ácido nucleico específico de diana que se inserta en una región no traducida en el sentido de 3 del gen de VP de parvovirus y puede expresarse bajo el control de un promotor o región promotora reconocible por una ARN polimerasa en la célula, en el que dicho ácido nucleico específico de diana puede transcribirse en una ¡ARN, y en el que dicho parvovirus puede replicarse y propagarse en la célula.

Parvovirus según la reivindicación 1, en el que el gen diana es un gen que provoca una enfermedad.

Parvovirus según la reivindicación 2, en el que el gen que provoca una enfermedad es un gen de virus animal patógeno, un gen relacionado con cáncer, un oncogén, un gen antiapoptótico, un gen crítico para el crecimiento de células tumorales, metástasis, angiogénesis o quimiorresistencia, un gen ¡nmunomodulador o un gen que codifica para una citocina, factor de crecimiento, enzima o factor de transcripción.

Parvovirus según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho parvovirus de roedor es Lulll, virus diminuto de ratón (MMV), parvovirus de ratón (MPV), virus diminuto de la rata (RMV), parvovirus de rata (RPV), virus de rata (RV) o H1 (H-1PV).

Parvovirus de roedor según la reivindicación 4, en el que el ácido nucleico específico de diana se inserta en el nucleótido 4683 del genoma de H-1PV de tipo natural.

Parvovirus según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el promotor o región promotora reconocible por una ARN polimerasa de la célula es un promotor de ARN polimerasa II (Pol II) o III (Pol III).

Parvovirus según la reivindicación 6, en el que el promotor de ARN polimerasa III (Pol III) es el promotor H1 de ARN polimerasa III.

Parvovirus según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el ácido nucleico específico de diana es un ARNhc.

Parvovirus según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el ácido nucleico específico de diana tiene una longitud de al menos 15 nucleótidos.

Parvovirus de roedor según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para su uso en el tratamiento de una enfermedad provocada por un gen de virus animal patógeno, un gen relacionado con cáncer, un oncogén, un gen antiapoptótico, un gen crítico para el crecimiento de células tumorales, metástasis, angiogénesis o quimiorresistencia, o una enfermedad asociada con la expresión aberrante de un gen ¡nmunomodulador o un gen que codifica para una citocina, factor de crecimiento, enzima o factor de transcripción.

Parvovirus según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para el uso según la reivindicación 10 caracterizado porque el uso es para tratar un tumor.

Parvovirus según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para el uso según la reivindicación 11 caracterizado porque el tumor es un tumor cerebral.

Parvovirus según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para el uso según la reivindicación 11 ó 12 caracterizado porque las células de dicho tumor son resistentes a la quimioterapia y/o la radioterapia.

Parvovirus según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para el uso según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13 caracterizado porque dicho parvovirus se administra mediante administración intravenosa (i.v.), intratumoral o endobronquial.

Célula que contiene un parvovirus según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.

Animal no humano transgénico que comprende una célula según la reivindicación 15.