Oxidorreductasas para la reducción estereoselectiva de compuestos cetónicos.

Procedimiento para la reducción enzimática enantioselectiva de un compuesto cetónico para dar el correspondiente compuesto de hidroxilo quiral,

en el que el compuesto cetónico se reduce en presencia de un cofactor con una oxidorreductasa, caracterizado porque

se usa una oxidorreductasa que se selecciona del grupo que está constituido por las oxidorreductasas para las que (a) codifica la secuencia de ácido nucleico SEC ID N.º: 12, o

(b) codifica una secuencia de ácido nucleico cuya cadena complementaria se hibrida con la secuencia de ácido nucleico mencionada en (a) en condiciones altamente rigurosas.

Oxidorreductasas para la reducción estereoselectiva de compuestos cetónicos La presente invención se refiere a un procedimiento para la reducción enzimática enantioselectiva de un compuesto cetónico para dar el correspondiente compuesto de hidroxilo quiral, en el que el compuesto cetónico se reduce con una oxidorreductasa. La invención se refiere además a nuevas oxidorreductasas para su uso en la reducción enantioselectiva de compuestos cetónicos para dar compuestos de hidroxilo quirales.

Los compuestos de hidroxilo ópticamente activos son módulos quirales valiosos con amplia aplicación para la síntesis de compuestos farmacológicamente activos, sustancias aromáticas, feromonas, compuestos agroquímicos e inhibidores de enzimas. A este respecto se registra en particular en el sector farmacéutico una necesidad creciente de compuestos quirales y por consiguiente tecnologías de síntesis quirales, dado que en el futuro ya apenas se usarán como fármacos los compuestos racémicos.

La reducción asimétrica de compuestos cetónicos proquirales es un sector de la catálisis estereoselectiva, en el que la biocatálisis representa una tecnología de competencia eficiente con respecto a la catálisis química. La hidrogenación asimétrica química requiere el uso de catalizadores de metales pesados con alto grado de toxicidad y contaminantes, de condiciones de reacción extremas y por consiguiente que requieren mucha energía así como grandes cantidades de disolventes orgánicos. Además, estos procedimientos están caracterizados con frecuencia por reacciones secundarias y excesos enantioméricos insuficientes.

Las reducciones de compuestos cetónicos proquirales para dar compuestos de hidroxilo y a la inversa se producen en la naturaleza en numerosas rutas bioquímicas, tanto en el metabolismo primario como en el metabolismo secundario, en cualquier organismo y se catalizan por distintos tipos de alcoholdeshidrogenasas secundarias y oxidorreductasas. Por regla general, estas enzimas dependen de cofactores.

La factibilidad principal del uso de biocatalizadores para la reducción de compuestos cetónicos proquirales para dar compuestos de hidroxilo quirales se demostró en el pasado de manera repetida por medio de sistemas de modelo, trabajándose tanto con oxidorreductasas aisladas como con distintos sistemas de biotransformación de células completas. A este respecto resultó ventajoso el planteamiento biocatalítico esencialmente con respecto a las condiciones de reacción suaves, productos secundarios ausentes y excesos enantioméricos obtenibles con frecuencia esencialmente mejores. El uso de enzimas aisladas es ventajoso en comparación con procedimientos con células completas con respecto al exceso enantiomérico obtenible, la producción de productos de degradación y secundarios como también con respecto al aislamiento del producto. Además no es posible el uso de procesos de células completas en cualquier empresa química, dado que para ello son necesarios un equipamiento especial y conocimientos técnicos.

Recientemente pudo mostrarse que el uso de oxidorreductasas aisladas en sistemas de dos fases acuoso/orgánicos con disolventes orgánicos es posible de manera sumamente eficaz, económica y también en altas concentraciones (> 5%) . En los sistemas descritos, a este respecto el compuesto cetónico que va a reducirse, en la mayoría de los casos poco soluble en agua forma junto con el disolvente orgánico la fase orgánica. Parcialmente puede prescindirse también del propio disolvente orgánico, entonces la fase orgánica se forma por el compuesto cetónico que va a reducirse (documentos DE 10119274, DE 10327454.4, DE 103 37 401.9, DE 103 00 335.5) . La regeneración de coenzimas se realiza a este respecto mediante la oxidación simultánea de alcoholes secundarios, usándose en la mayoría de los casos el 2-propanol miscible con agua, económico.

Son ejemplos de oxidorreductasas y deshidrogenasas R-y S-específicas adecuadas de alta enantioselectividad:

carbonilrreductasa de Candida parapsilosis (CPCR) (documentos US 5.523.223 y US 5.763.236, (Enzyme Microb Technol. 1993 Nov;15 (11) :950-8) ) y Pichia capsulata (documento DE10327454.4) . Carbonilrreductasa de Rhodococcus er y thropolis (RECR) (documento US 5.523.223) , Norcardia fusca (Biosci. Biotechnol. Biochem., 63

(10) (1999) , páginas 1721-1729) , (Appl Microbiol Biotechnol. Sep de 2003; 62 (4) :380-6. Epub 26 de abril de 2003) , y Rhodococcus ruber (J Org Chem. 24 de enero de 2003; 68 (2) :402-6.) .

Alcoholdeshidrogenasas secundarias R-específicas de organismos del género Lactobacillus (Lactobacillus kefir (documento US5200335) , Lactobacillus brevis (documento DE 19610984 A1) (Acta Cr y stallogr D Biol Cr y stallogr. diciembre de 2000; 56 Pt12:1696-8) , Lactobacillus minor (documento DE10119274) o Pseudomonas (documento US 05385833) (Appl Microbiol Biotechnol. agosto de 2002; 59 (4-5) :483-7. Epub 26 de junio de 2002, J. Org. Chem. 1992, 57, 1532)

Sin embargo, las enzimas conocidas actualmente no son ni remotamente suficientes para aprovechar todo el potencial comercial de reducciones estereoselectivas de compuestos cetónicos. Esto puede basarse por un lado en que las enzimas individuales disponen de propiedades muy distintas con respecto al espectro de sustrato, grados óptimos de pH así como estabilidades frente a temperatura y disolventes, que con frecuencia se complementan mutuamente. Por tanto, incluso enzimas homólogas proporcionalmente similares pueden presentar con respecto a un determinado sustrato un comportamiento de reacción completamente distinto. Por otro lado ni muchos menos todas las enzimas descritas están clonadas ni pueden sobre-expresarse en cantidad suficiente, lo que significa que

estas enzimas no están a disposición para una aplicación industrial. Por tanto es necesario para el aprovechamiento lo más amplio posible del potencial sintético de la hidrogenación asimétrica enzimática, disponer de una cartera lo más amplia posible de distintas oxidorreductasas accesibles industrialmente que además sean adecuadas para una aplicación en sistemas de dos fases acuoso/orgánicos con disolventes orgánicos.

El objeto de la presente invención son ahora una serie de nuevas oxidorreductasas enantioselectivas, R-y Sespecíficas que se caracterizan por buena estabilidad en sistemas de dos fases acuoso/orgánicos así como por buena capacidad de expresión en Escherichia coli (>500 unidades/g de biomasa húmeda de E. coli) , así como un procedimiento para la reducción enzimática enantioselectiva de un compuesto cetónico para dar el correspondiente compuesto de hidroxilo quiral.

Las oxidorreductasas de acuerdo con la invención están caracterizadas porque presentan una secuencia de aminoácidos, en la que al menos el 75 % de los aminoácidos son idénticos a los aminoácidos de la secuencia de aminoácidos SEC ID Nº 4.

El polipéptido que corresponde a SEC ID Nº 4 puede obtenerse a partir de bacterias del grupo Leuconostoc, en particular a partir de Leuconostoc carnosum DSMZ 5576. Es objeto de la invención además una secuencia de ácido nucleico SEC ID Nº 12, que codifica una proteína con la secuencia de aminoácidos SEC ID Nº 4. El polipéptido es adecuado especialmente para la reducción de 2-octanona para dar R-2-octanol y para la oxidación de R-2-octanol. También es muy adecuado para la reducción de éster de 4-haloacetoacetato para dar ésteres de ácido S-4-halo-3hidroxibutírico.

La oxidorreductasa de Leuconostoc carnosum es un homodímero con un peso molecular determinado en gel SDS de 276 2 kDa. El grado óptimo de pH para la reacción de reducción se encuentra para esta oxidorreductasa en el intervalo de 5, 0 a 6, 0 y el grado óptimo de pH para la reacción de oxidación se encuentra en el intervalo de 6, 0-9, 0. La oxidorreductasa de Leuconostoc carnosum presenta una buena estabilidad frente a la temperatura, pH y disolventes y muestra en el intervalo de pH de 4, 5 a 10 así como a temperaturas de hasta 35 º C también en tiempos de incubación de varias horas una pérdida de actividad sólo baja.

La invención se refiere además a proteínas de fusión que están caracterizadas porque representan oxidorreductasas con la secuencia de aminoácidos SEC ID Nº 4, o sus homólogos, que están unidas peptídicamente con otro polipéptido en el extremo N terminal o carboxilo terminal. Las proteínas de fusión pueden separarse por ejemplo más fácilmente de otras proteínas o pueden expresarse de manera recombinante en cantidades mayores.

La invención se refiere además a anticuerpos que se unen específicamente a las oxidorreductasas de acuerdo con SEC ID Nº 4, o sus homólogos. La preparación de estos anticuerpos... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para la reducción enzimática enantioselectiva de un compuesto cetónico para dar el correspondiente compuesto de hidroxilo quiral, en el que el compuesto cetónico se reduce en presencia de un cofactor con una oxidorreductasa, caracterizado porque se usa una oxidorreductasa que se selecciona del grupo que está constituido por las oxidorreductasas para las que

(a) codifica la secuencia de ácido nucleico SEC ID Nº : 12, o

(b) codifica una secuencia de ácido nucleico cuya cadena complementaria se hibrida con la secuencia de ácido nucleico mencionada en (a) en condiciones altamente rigurosas.

2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque el compuesto cetónico presenta la 10 fórmula general I

R1-C (O) -R2 (I) ,

en la que R1 representa uno de los restos 1) alquilo (C1-C20) , en el que alquilo es de cadena lineal o ramificada, 2) alquenilo (C2-C20) , en el que alquenilo es de cadena lineal o ramificada y eventualmente contiene hasta cuatro

dobles enlaces, 3) alquinilo (C2-C20) , en el que alquinilo es de cadena lineal o ramificada y eventualmente contiene hasta cuatro triples enlaces, 4) arilo (C6-C14) , 5) alquil- (C1-C8) -arilo (C6-C14) ,

6) heterociclo (C5-C14) , que está no sustituido o sustituido una, dos o tres veces con -OH, halógeno, -NO2 y/o -NH2, o 7) cicloalquilo (C3-C7) , estando los restos mencionados anteriormente en 1) a 7) no sustituidos o independientemente entre sí están sustituidos una, dos o tres veces con -OH, halógeno, -NO2 y/o -NH2,

y R2 representa uno de los restos 8) alquilo (C1-C6) , en el que alquilo es de cadena lineal o ramificada, 9) alquenilo (C2-C6) , en el que alquenilo es de cadena lineal o ramificada y eventualmente contiene hasta tres dobles enlaces, 10) alquinilo (C2-C6) , en el que alquinilo es de cadena lineal o ramificada y eventualmente contiene dos triples enlaces, o 11) alquil- (C1-C10) -C (O) -O-alquilo (C1-C6) , en el que alquilo es lineal o ramificado y está no sustituido o está sustituido una, dos o tres veces con -OH, halógeno, -NO2 y/o -NH2, estando los restos mencionados anteriormente en 8) a 11) no sustituidos o independientemente entre sí están sustituidos una, dos o tres veces con -OH, halógeno, -NO2 y/o -NH2.

3. Vector de clonación, que contiene una o varias secuencias de ácido nucleico que codifican la oxidorreductasa de acuerdo con SEC ID Nº : 4.

4. Vector de expresión, que se encuentra en una célula bacteriana, de insecto, vegetal o de mamífero in vitro y contiene una secuencia de ácido nucleico que codifica la oxidorreductasa de acuerdo con SEC ID Nº : 4 y está unida con una secuencia control de expresión.

5. Célula huésped recombinante que es una célula bacteriana, de insecto, vegetal o de mamífero y se transformó o se transfectó con un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 4.

6. Oxidorreductasa para su uso en un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, caracterizada porque se codifica por la secuencia de ácido nucleico que se selecciona del grupo que está constituido por SEC ID Nº : 12 y una secuencia de ácido nucleico cuya cadena complementaria se hibrida con la secuencia SEC ID Nº : 12 en 45 condiciones altamente rigurosas.

7. Procedimiento para la reducción enzimática enantioselectiva de un compuesto cetónico para dar el correspondiente compuesto de hidroxilo quiral, en el que el compuesto cetónico se reduce con una oxidorreductasa en presencia de un co-factor, caracterizado porque se usa una oxidorreductasa que presenta una secuencia de aminoácidos en la que al menos el 75 % de los aminoácidos son idénticos a los aminoácidos de la secuencia de 50 aminoácidos SEC ID Nº : 4.