Procedimiento de obtención de variantes de bacterias lácticas útiles para producir la vitamina K2 y aplicaciones para la preparación de productos alimenticios.

Procedimiento de selección de una variante natural de una cepa de bacteria láctica que produce,

en unas condiciones de fermentación estándar, una cantidad de vitamina K2 superior, en un factor por lo menos igual a 1,2, a la producida por dicha cepa de bacteria láctica cultivada en las mismas condiciones, comprendiendo dicho procedimiento por lo menos:

a) el cultivo de dicha cepa de bacteria láctica en unas condiciones de fermentación estándar, en un medio de selección seleccionado de entre medios de cultivo que contienen bacitracina o un agente oxidante tal como el peróxido, que induce una modificación del estado de óxido-reducción celular; y

b) la selección de dicha variante si produce por lo menos 1,2 veces más vitamina K2 que dicha cepa de bacteria láctica cultivada en las mismas condiciones.

Procedimiento de obtención de variantes de bacterias lácticas útiles para producir la vitamina K2 y aplicaciones para la preparación de productos alimenticios.

La presente invención se refiere al campo de los productos alimenticios ricos en nutrientes, vitaminas y/u oligoelementos con el fin de mejorar el contenido y equilibrio cualitativo y cuantitativo de las aportaciones nutricionales en el ser humano.

La invención se refiere más particularmente a los medios para enriquecer los alimentos con vitamina K.

De manera más precisa, la presente invención se refiere a la obtención de variantes de cepas de bacterias lácticas que producen, en unas condiciones de fermentación estándar, por lo menos aproximadamente 1, 2 veces más vitamina K2 que las cepas de bacterias lácticas de partida cultivadas en las mismas condiciones.

La invención también se refiere a un procedimiento para preparar productos alimenticios, en particular productos fermentados y/o productos lácteos frescos, enriquecidos con vitamina K2, así como a los productos alimenticios así obtenidos.

La vitamina K es una vitamina liposoluble que se presenta en dos formas naturales: la vitamina K1 (o filoquinona) y la vitamina K2 (o menaquinona) .

La vitamina K1 es sintetizada por los vegetales. Se encuentra principalmente en las hortalizas verdes (hortalizas de hoja) y en el aceite de soja. La vitamina K1 interviene más directamente en el proceso de coagulación de la sangre.

En cuanto a la vitamina K2, es producida por las bacterias de la flora intestinal. También aparece en cantidades pequeñas en ciertos alimentos después de un proceso de fermentación (queso, productos asiáticos típicos tales como el miso y el natto japonés, a base de soja fermentada, etc.) . Numerosas bacterias son capaces de sintetizar la vitamina K2. Así, además de las bacterias de la flora intestinal, y en particular las especies Escherichia coli, Bacillus subtilis y Bacteroides spp., se pueden citar ciertas especies o subespecies de bacterias lácticas tales como Lactococcus lactis spp. lactis, Lactococcus lactis spp. cremoris, Leuconostoc lactis, Leuconostoc mesenteroides y Propionibacterium sp. La cantidad de vitamina K2 sintetizada por estas bacterias generalmente varía de aproximadamente 29 a 90 μg/l de leche fermentada (Morishita et al., 1999) . Es importante subrayar que las mediciones de producción de vitamina K2 se realiza más frecuentemente a partir de liofilizados de residuos celulares y los resultados de estas mediciones revela una gran heterogeneidad de los niveles de producción en función de las cepas ensayadas, que puede variar de la unidad a más del triple (Morishita et al., 1999; Parker et al., 2003) . En términos de actividad biológica, la vitamina K2 se conoce sobre todo por su acción sobre la calcificación de los tejidos blandos.

La vitamina K se ha descrito inicialmente por su papel esencial en el proceso de coagulación de la sangre. Así, grandes carencias de vitamina K conducen a hemorragias, con alargamiento anormal del tiempo de coagulación, y a equimosis. Durante largo tiempo, se ha considerado que las carencias grandes de vitamina K eran más bien raras en el adulto, pudiendo las necesidades estar cubiertas en principio de manera satisfactoria por una alimentación variada y equilibrada y gracias a la producción endógena de la vitamina por las bacterias cólicas. A este respecto, las personas en riesgo son típicamente:

- los recién nacidos, cuyos intestinos en el nacimiento no tienen las bacterias que producen vitamina K;

- las personas cuyas funciones hepáticas, biliares o intestinales están perturbadas (enfermedades hepáticas, mucoviscidosis, colitis, disenterías, etc.) ; e -quien toman antibióticos durante mucho tiempo.

Más recientemente, se ha descubierto que el impacto de la vitamina K en la salud humana no se limitaba a su papel en los mecanismos de coagulación sanguínea. De hecho, desde los años 80, la vitamina K también se ha reconocido por su papel en el metabolismo óseo (Hart et al., 1984; Hart et al., 1985) .

Esta vitamina desempeña la función de cofactor en una reacción enzimática que condiciona la actividad de osteocalcina en el marco de la regulación de la formación ósea (Hauschka PV et al., 1989; Ducy P et al., 1996) . Su papel consiste de manera más precisa en condicionar la carboxilación de la osteocalcina, proteína clave que regula el proceso de formación ósea. En el caso de carencia de vitamina K, esta reacción no tiene lugar, provocando el aumento de la proporción sanguínea entre osteocalcina descarboxilada y osteocalcina carboxilada (VÃÃnÃnen et al., 1999) .

La evolución demográfica de los países occidentales se ha traducido en un envejecimiento progresivo de la población, asociado corolariamente a un incremento de la prevalencia de las patologías degenerativas, en particular

de la osteoporosis. A este respecto, la osteoporosis se reconoce desde entonces como un problema principal de salud pública.

Las estimaciones demográficas realizadas en los años 90 han hecho sonar la alarma al prever un incremento considerable de la incidencia de esta patología en los siguientes 50 años, en particular en personas de la tercera edad. Por lo tanto, se ha impuesto rápidamente la necesidad y la urgencia de tomar acciones con el fin de prevenir esta patología, hasta entonces poco investigada y tratada de manera tardía.

Ahora se reconoce que la prevención de la osteoporosis debe comenzar desde la niñez, a través de un crecimiento óseo óptimo, y continuar toda la vida mediante un mantenimiento de la masa ósea. Se sabe que los factores nutricionales juegan un papel importante en el desarrollo y el mantenimiento del patrimonio óseo. Hasta ahora, las estrategias nutricionales contempladas o propuestas para prevenir la osteoporosis se basan esencialmente en dos factores clave que son el calcio y la vitamina D. Sin embargo, se sabe ahora que otros factores nutricionales podrían presentar un interés notable.

Debido a su papel principal en la formación ósea, la vitamina K aparece cada vez más en la bibliografía como una vía prometedora para preservar la salud ósea del ser humano a lo largo de la vida.

Las aportaciones nutricionales recomendadas de vitamina K en el ser humano (1, 5 μg/día/kg de peso corporal) se han establecido considerando únicamente su papel en los fenómenos de coagulación. Ahora bien, unos estudios recientes sugieren que estas aportaciones recomendadas se subestiman finalmente si se considera también la actividad de la vitamina K en el metabolismo óseo (Ronden et al., 1998) .

Aunque las necesidades de vitamina K aún se conocen poco, esto no quiere decir que bajas aportaciones se asocien a una baja masa ósea y a un riesgo incrementado de fracturas en el adulto (Hart et al., 1985; Knapen et al., 1989; Szulc et al., 1993; Booth et al, 2000) . Además, unos estudios de intervención en mujeres menopáusicas han demostrado que la vitamina K podía permitir disminuir las pérdidas óseas para este grupo objetivo (Shiraki et al., 2000; Braam et al., 2003) . Por último, unos estudios en el animal sugieren que podría jugar un papel favorable durante el pico de masa ósea, tanto mejor en el caso de asociación sinérgica con la vitamina D. Sin embargo, los estudios que relacionan claramente la vitamina K y el crecimiento óseo solamente se han realizado hasta ahora en el animal.

Además, unos estudios recientes han permitido aportar argumentos adicionales en favor del impacto de la vitamina K en el metabolismo óseo y, en particular, en la constitución y la preservación de la masa ósea (Booth et al., 2000; Shiraki et al., 2000; Braam et al., 2003; Hirano e Ishi, 2002) .

Al contrario que en el adulto, existen pocos datos disponibles en cuanto a los efectos benéficos de la vitamina K en el metabolismo óseo del niño. Solamente se sabe que es esencial optimizar la masa ósea durante el periodo de crecimiento, con el fin de constituir una reserva ósea máxima y proteger al adulto contra el riesgo de osteoporosis futura.

En cualquier caso, se desprende del conjunto de los datos disponibles actualmente que la mejora del contenido de vitamina K de los productos alimenticios es una vía particularmente interesante y prometedora para permitir que el individuo construya y mantenga una buena constitución ósea.

En este contexto, ya existen unos productos industriales en el mercado alimentario que contienen una cantidad notable de vitamina K. Se pueden citar en particular ciertos productos lácteos que contienen bacterias lácticas, tales como "Petits Gervais aux Fruits" vendidos en Francia por el solicitante. Sin embargo, se observará que, por un lado,... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento de selección de una variante natural de una cepa de bacteria láctica que produce, en unas condiciones de fermentación estándar, una cantidad de vitamina K2 superior, en un factor por lo menos igual a 1, 2, a la producida por dicha cepa de bacteria láctica cultivada en las mismas condiciones, comprendiendo dicho procedimiento por lo menos:

a) el cultivo de dicha cepa de bacteria láctica en unas condiciones de fermentación estándar, en un medio de selección seleccionado de entre medios de cultivo que contienen bacitracina o un agente oxidante tal como el 10 peróxido, que induce una modificación del estado de óxido-reducción celular; y b) la selección de dicha variante si produce por lo menos 1, 2 veces más vitamina K2 que dicha cepa de bacteria láctica cultivada en las mismas condiciones.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado por que dicha cepa de bacteria láctica se selecciona de entre los géneros Lactococcus, Leuconostoc, Enterococcus y Propionibacterium.

3. Procedimiento según la reivindicación 2, caracterizado por que dicha cepa de bacteria láctica se selecciona de entre las especies Lactococcus lactis, Leuconostoc lactis, Leuconostoc pseudomesenteroides, Leuconostoc 20 mesenteroides, Leuconostoc dextranicum, Enterococcus faecium, y Propionibacterium sp.

4. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por que la expresión de por lo menos un gen seleccionado de entre los genes 1 a 27 siguientes:

nº del gen Nombre del gen Función de la proteína correspondiente nº de acceso NCBI.

cys D O-acetilhomoserina sulfhidrilasa IImg_0091

gpo Proteína gpo (glutation peroxidasa) IImg_1088

metE 5-metiltetrahidropteroiltriglutamato-homocisteína metiltransferasa IImg_1225

NADH deshidrogenasa putativa IImg_0195

metF Proteína MetF Metileno tetrahidrofolato reductasa IImg_1226

trxH Tioredoxina tipo H IImg_0406

fur Proteína de regulación de la asimilación férrica IImg_1023

qor Quinona oxidoreductasa IImg_1850

frdc Subunidad de flavoproteína fumarato reductasa IImg_1441

adhE Alcohol-acetaldehído deshidrogenasa IImg_2432

purC Fosforibosilaminoimidazol-succinocarboxamida sintasa IImg_0973

cydB Citocromo d ubiquinol oxidasa, subunidad II IImg_1863

purE Subunidad catalítica fosforibosilaminoimidazol carboxilasa IImg_0999

purQ Fosforibosilformilglicinamidina sintasa I IImg_0975

trxA Tioredoxina IImg_0779

noxB Deshidrogenasa NADH IImg_1734

cpo Cloruro de peroxidasa no hemo IImg_1737

metK Proteína MetK S-adenosilmetionina sintasa IImg_2160

trxB1 Proteína TrxB1 tioredoxina reductasa IImg_1588

cysK O-acetilserina sulfhidrilasa IImg_1775

metC Cistationina beta-liasa IImg_1776

metS Proteína MetS Metionil-ARNt sintetasa IImg_1764

feoB Homólogo de la proteína B de transporte de hierro ferroso IImg_0199

citB Aconitato hidratasa IImg_0636

icd Isocitrato deshidrogenasa IImg_0637

fhuD Proteína afín del sustrato del sistema de transporte ABC del ferricromo IImg_0349

Idh L-lactato deshidrogenasa IImg_1120

está modificada en dicha variante con respecto a dicha cepa de bacterias lácticas.

5. Procedimiento según la reivindicación 4, caracterizado por que la expresión de por lo menos un gen seleccionado de entre los genes 1 a 15 aumenta en dicha variante con respecto a dicha cepa de bacteria láctica. 30

6. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 4 o 5, caracterizado por que la expresión de por lo menos un gen seleccionado de entre los genes 16 a 27 se reduce en dicha variante con respecto a dicha cepa de bacteria láctica.

7. Variante natural de una cepa de bacteria láctica, resistente a la bacitracina, y que produce, en unas condiciones 14

de fermentación estándar, una cantidad de vitamina K2 superior, en un factor por lo menos igual a 1, 2, a la producida por dicha cepa de bacteria láctica cultivada en las mismas condiciones, caracterizada por que es la variante natural I-3557 depositada en la Colección Nacional de Cultivo de Microorganismos (CNCM, Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, Francia) el 20 de enero de 2006.

8. Variante natural de una cepa de bacteria láctica, resistente a un agente oxidante tal como el peróxido, y que produce, en unas condiciones de fermentación estándar, una cantidad de vitamina K2 superior, en un factor por lo menos igual a 1, 2, a la producida por dicha cepa de bacteria láctica cultivada en las mismas condiciones, caracterizada por que es la variante natural I-3558 depositada en la Colección Nacional de Cultivo de Microorganismos (CNCM, Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, Francia) el 20 de enero de 2006.

9. Utilización de la resistencia a la bacitracina para seleccionar unas variantes naturales de cepas de bacterias lácticas que producen, en unas condiciones de fermentación estándar, una cantidad de vitamina K2 superior, en un factor por lo menos igual a 1, 2, a la producida por dicha cepa de bacteria láctica cultivada en las mismas condiciones.

10. Utilización de la resistencia a un agente oxidante, tal como el peróxido, para seleccionar unas variantes naturales de cepas de bacterias lácticas que producen, en unas condiciones de fermentación estándar, una cantidad de vitamina K2 superior, en un factor por lo menos igual a 1, 2, a la producida por dicha cepa de bacteria láctica cultivada en las mismas condiciones.

11. Fermento láctico que comprende por lo menos una variante según cualquiera de las reivindicaciones 7 y 8.

12. Procedimiento de producción de un producto alimenticio enriquecido con vitamina K2 que comprende por lo menos:

a) utilizar por lo menos una variante según cualquiera de las reivindicaciones 7 y 8, y/o por lo menos un fermento según la reivindicación 11, en una preparación intermedia de dicho producto; y 30 b) obtener dicho producto enriquecido con vitamina K2.

13. Producto alimenticio enriquecido con vitamina K2, que comprende por lo menos una variante según cualquiera de las reivindicaciones 7 y 8, y/o por lo menos un fermento según la reivindicación 11, susceptible de ser obtenido 35 mediante un procedimiento según la reivindicación 12.