Nuevos lipopéptidos inmunógenos que comprenden epítopos de linfocitos T auxiliares y de linfocitos T citotóxicos (CTL).

Un lipopéptido que comprende un polipéptido conjugado a uno o más restos lipídicos,

en el que:

(i) dicho polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que comprende:

(a) la secuencia de aminoácidos de un epítopo de linfocitos T auxiliares (Th) y la secuencia de aminoácidos de un epítopo de linfocitos T citotóxicos (CTL), en el que dichas secuencias de aminoácidos son diferentes; y

(b) uno o más restos de lisina interna para la unión covalente de cada uno de dichos restos lipídicos a través del grupo amino en épsilon de dicha lisina; y

(ii) cada uno de dicho uno o más restos lipídicos se une covalentemente al polipéptido a través de un grupo amino en épsilon de dicho uno o más restos de lisina interna;

en el que el resto de lisina interna al que está unido el resto lipídico está localizado entre el epítopo de Th y el epítopo de CTL.

Nuevos lipopéptidos ¡nmunógenos que comprenden epftopos de linfocitos T auxiliares y de linfocitos T citotóxicos (CTL)

Campo de la invención

La presente invención se refiere en general al campo de la inmunología, y más particularmente a reactivos para generar respuestas celulares contra un inmunógeno peptídico, y a métodos para usar dichos reactivos para potenciar la respuesta inmunitaria de un sujeto, o para la vacunación de un sujeto. Incluso más específicamente, la descripción se refiere a nuevos lipopéptidos que tienen actividad inmunógena potenciada, específicamente una capacidad potenciada para activar una respuesta de linfocito T frente a un epítopo de linfocito T CD8+ para inducir inmunidad mediada por células frente a un patógeno invasor o una célula tumoral. También proporciona formulaciones y composiciones de vacuna que comprenden dichos lipopéptidos, tales como, por ejemplo, en combinación con un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable, y métodos para preparar y usar las formulaciones y composiciones de vacuna de la invención.

Antecedentes de la invención

1. General

Esta memoria descriptiva contiene información de secuencia de aminoácidos preparada usando Patentln Versión 3.1, presentada en el presente documento tras el Resumen. Cada secuencia se identifica en el listado de secuencias mediante el indicador numérico <21> seguido del identificador de secuencia (por ejemplo, <21>1, <21>2, etc.). La longitud de cada secuencia y el organismo fuente se indican mediante la información proporcionada en los campos del indicador numérico <211 > y <213>, respectivamente. Las secuencias a las que se hace referencia en la memoria descriptiva se definen mediante la expresión "SEC ID NO:", seguida del identificador de secuencia (por ejemplo, SEC ID NO: 1 se refiere a la secuencia designada como <4>1).

Tal como se usa en el presente documento, la expresión "derivado de" debe tomarse para indicar que puede obtenerse un número entero especificado a partir de una fuente particular, aunque no necesariamente de manera directa de esa fuente.

En toda esta memoria descriptiva, a menos que el contexto requiera otra cosa, la palabra "comprender", o variaciones tales como "comprende" o "que comprende", se entenderá que implican la inclusión de una etapa o elemento o número entero establecidos, o grupo de etapas o elementos o números enteros, pero no la exclusión de ninguna otra etapa o elemento o número entero o grupo de elementos o números enteros.

La presente invención se realiza sin experimentación excesiva usando, a menos que se indique de otro modo, técnicas convencionales de biología molecular, microbiología, virología, tecnología de ADN recombinante, síntesis de péptidos en disolución, síntesis de péptidos en fase sólida, e inmunología. Tales procedimientos se describen, por

ejemplo:

1. Sambrook, Fritsch y Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Coid Spring Harbor Laboratories, Nueva York, Segunda Edición (1989), los Vol I, II, y III completos;

2. DNA Cloning: A Practical Approach, Vol. I y II (D. N. Glover, ed., 1985), IRL Press, Oxford, texto completo;

3. Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach (M. J. Gait, ed., 1984) IRL Press, Oxford, texto completo, y particularmente los artículos en el mismo de Gait, págs.1-22; Atkinson et al., págs. 35-81; Sproat et al., págs. 83- 115; y Wu et al., págs 135-151;

4. Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach (B. D. Hames & S. J. Higgins, eds., 1985) IRL Press, Oxford, texto completo;

5. Animal Cell Culture: Practical Approach, Tercera Edición (John R.W. Masters, ed., 2), ISBN 19963797, texto completo;

6. Immobilized Cells and Enzymes: A Practical Approach (1986) IRL Press, Oxford, texto completo;

7. Perbal, B., A Practical Guideto Molecular Cloning (1984);

8. Methods In Enzymology (S. Colowick y N. Kaplan, eds., Academic Press, Inc.), series completas;

9. J.F. Ramalho Ortigáo, "The Chemistry of Peptide Synthesis" En: Knowledge database of Access to Virtual Laboratory website (Interactiva, Alemania);

1. Sakakibara, D., Teichman, J., Lien, E. L y Fenichel, R.L. (1976). Biochem. Biophys. Res. Commun. 73 336- 342

11. Merrifield, R.B. (1963). J. Am. Chem. Soc. 85, 2149-2154.

12. Barany, G. y Merrifield, R.B. (1979) en The Peptides (Gross, E. y Meienhofer, J. eds.), vol. 2, págs. 1-284, Academic Press, Nueva York.

13. Wünsch, E., ed. (1974) Synthese von Peptidon en Houben-Weyls Methoden der Organischen Chemie (Müler, E., ed.), vol. 15, 4a ed., Partes 1 y 2, Thieme, Stuttgart

14. Bodanszky, M. (1984) Principies of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Heidelberg.

15. Bodanszky, M. y Bodanszky, A. (1984) The Practice of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Heidelberg.

16. Bodanszky, M. (1985) Int. J. Peptide Protein Res. 25, 449-474.

17. Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D. M. Weir y C. C. Blackwell, eds., 1986, Blackwell Scientific Publications).

Descripción de la técnica relacionada

La inmunoterapia o vacunación son atractivas para la profilaxis o terapia de una amplia variedad de trastornos, tales como, por ejemplo, ciertas enfermedades infecciosas o cánceres. Sin embargo, la aplicación y el éxito de tales tratamientos están limitados en parte por la escasa inmunogenicidad del epítopo de CTL diana. Los péptidos sintéticos, que representan inmunógenos de linfocitos T, provocan solamente inmunidad débil cuando se suministran aisladamente y, como consecuencia, son muy eficaces en composiciones de vacuna. Las proteínas de longitud completa que contienen epítopos de CTL no entran eficientemente en la ruta de procesamiento del MHC clase I. Adicionalmente, los epítopos de CTL están restringidos para HLA, y un gran grado de polimorfismo de HLA en poblaciones humanas significa que las vacunas a base de CTL pueden no proporcionar cobertura amplia a todos los genotipos en una población.

Se usan varias técnicas para potenciar la respuesta inmunitaria de un sujeto contra un inmunógeno peptídico.

Se conoce que la utilización de una formulación adyuvante que es extrínseca al inmunógeno peptídico (es decir, se mezcla con el inmunógeno antes de su uso), tal como, por ejemplo, adyuvante completo de Freund (CFA), potenciará la respuesta inmunitaria de un sujeto contra un inmunógeno peptídico. Sin embargo, muchos de los adyuvantes disponibles actualmente son demasiado tóxicos para su uso en seres humanos, o simplemente son ineficaces. Además, los adyuvantes de este tipo requieren la formulación previa con el inmunógeno peptídico inmediatamente antes de la administración, teniendo tales formulaciones a menudo una baja solubilidad o siendo insolubles.

Los lipopéptidos, en los que un resto lipídico que se sabe que actúa como un adyuvante se acopla covalentemente a un inmunógeno peptídico, pueden ser capaces de potenciar la inmunogenicidad de un péptido inmunógeno, de otro modo débil, en ausencia de un adyuvante extrínseco [Jung et al., Angew Chem, Int Ed Engl 1, 872, (1985); Martinon et al., J Immunol 149, 3416, (1992); Toyokuni et al., J Am Chem Soc 116, 395, (1994); Deprez, et al., J Med Chem 38, 459, (1995); y Sauzet et al., Vaccine 13, 1339, (1995); Benmohamed et al., Eur. J. Immunol. 27, 1242, (1997); Wiesmuller et al., Vaccine 7, 29, (1989); Nardin et al., Vaccine 16, 59, (1998); Benmohamed, et al. Vaccine 18, 2843, (2); y Obert, et al., Vaccine 16, 161, (1998)]. Los lipopéptidos adecuados no muestran ninguno de los efectos secundarios perjudiciales asociados con las formulaciones de adyuvante, y se han observado tanto respuestas de anticuerpos como celulares frente a lipopéptidos.

Se conocen varios ácidos grasos diferentes para uso en restos lipidíeos. Los ácidos grasos a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, grupos palmitoílo, miristoílo, estearoílo y decanoílo, o, más generalmente, se piensa que es útil cualquier grupo de ácido graso de C2 a C3 saturado, monoinsaturado, o poliinsaturado.

El lipoaminoácido N-palmitoil-S-[2,3-bis(palmitoiloxi)propil]cisteína, también conocido como PamsCys o Panri3Cys-OH (Wiesmuller et al., Z. PhysioLChem. 364 (1983), p593), es una versión sintética del resto N-terminal de la lipoproteína de Braun que abarca las membranas interna y externa de bacterias gramnegativas. PamsCys tiene la estructura de fórmula (l):

H3C----------(CH2)i4-------CO------NH------CH-----COOH

CH2

S

CH2

I

H3C(CH2)14-----CO-------O------CH

H3C(CH2)14-----COoch2

La patente estadounidense n° 5.7.91 concedida a Metzger et al (23 de diciembre de 1997) describe varias... [Seguir leyendo]

1. Un lipopéptido que comprende un polipéptido conjugado a uno o más restos lipidíeos, en el que:

(i) dicho polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que comprende:

(a) la secuencia de aminoácidos de un epítopo de linfocitos T auxiliares (Th) y la secuencia de aminoácidos de un epítopo de linfocitos T citotóxicos (CTL), en el que dichas secuencias de aminoácidos son diferentes; y

(b) uno o más restos de lisina interna para la unión covalente de cada uno de dichos restos lipidíeos a través del grupo amino en épsilon de dicha lisina; y

(ii) cada uno de dicho uno o más restos lipidíeos se une covalentemente al polipéptido a través de un grupo amino en épsilon de dicho uno o más restos de lisina interna;

en el que el resto de lisina interna al que está unido el resto lipídico está localizado entre el epítopo de Th y el epítopo de CTL.

2. El lipopéptido según la reivindicación 1, en el que el resto lipídico tiene una estructura de Fórmula General (Vil):

Fórmula (Vil)

Rt-------NH------CH-------COOH

I

(CH2)m

X

I

(CH2)n

R2-----CH

R3------CH2

en la que:

(i) X se selecciona del grupo que consiste en azufre, oxígeno, disulfuro (-S-S-), y metileno (-CH2-), y amino (- NH-);

(ii) m es un número entero que es 1 ó 2;

(iii) n es un número entero de a 5;

(iv) R1 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, carbonilo (-CO-), y R-CO-, en el que R se selecciona del grupo que consiste en alquilo que tiene 7 a 25 átomos de carbono, alquenilo que tiene 7 a 25 átomos de carbono, y alquinilo que tiene 7 a 25 átomos de carbono, en el que dicho grupo alquilo, alquenilo o alquinilo está opcionalmente sustituido con un grupo hidroxilo, amino, oxo, acilo o cicloalquilo;

(v) R2 se selecciona del grupo que consiste en R-CO-O-, R-O-, R-O-CO-, R-NH-CO-, y R-CO-NH-, en los

que R se selecciona del grupo que consiste en alquilo que tiene 7 a 25 átomos de carbono, alquenilo que

tiene 7 a 25 átomos de carbono, y alquinilo que tiene 7 a 25 átomos de carbono, en el que dicho grupo

alquilo, alquenilo o alquinilo está opcionalmente sustituido con un grupo hidroxilo, amino, oxo, acilo o cicloalquilo; y

(vi) R3 se selecciona del grupo que consiste en R-CO-O-, R-O-, R-O-CO-, R-NH-CO-, y R-CO-NH-, en los

que R se selecciona del grupo que consiste un alquilo que tiene 7 a 25 átomos de carbono, alquenilo que

tiene 7 a 25 átomos de carbono, y alquinilo que tiene 7 a 25 átomos de carbono, en el que dicho grupo

alquilo, alquenilo o alquinilo está opcionalmente sustituido con un grupo hidroxilo, amino, oxo, acilo, o cicloalquilo;

y en la que cada uno de R1, R2 y R3 son iguales o diferentes.

3. El lipopéptido según la reivindicación 2, en el que X es azufre; m y n son ambos 1; R1 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, y R-CO-, en el que R es un grupo alquilo que tiene 7 a 25 átomos de carbono; y R2 y R3 se

seleccionan del grupo que consiste en R-CO-O-, R-O-, R-O-CO-, R-NH-CO-, y R-CO-NH-, en el que R es un grupo alquilo que tiene 7 a 25 átomos de carbono.

4. El llpopéptido según la reivindicación 3, en el que R se selecciona del grupo que consiste en: palmltoílo, miristollo, estearoílo, laurollo, octanollo, decanollo, y colesterol.

5. El lipopéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en el que el lípido está contenido dentro de un resto de lipoamlnoácldo seleccionado del grupo que consiste en: Parn-iCys, Pam2Cys, Pam3Cys, Chol2Lys, Ste2Cys, Lau2Cys, y Oct2Cys.

6. El lipopéptido según la reivindicación 5, en el que el resto de llpoaminoácido es Pam2Cys.

7. El lipopéptido según la reivindicación 1, en el que el resto llpldlco tiene la siguiente Fórmula General (VIII):

Fórmula (VIII)

R4------NH------CH------COOH

r5

en la que:

(i) R4 se selecciona del grupo que consiste en: (i) un resto de alfa-acil-ácido graso que consiste en entre alrededor de 7 y alrededor de 25 átomos de carbono; (ii) un resto de alfa-alquil-beta-hidroxi-ácldo graso; (¡¡i) un beta-hidroxiéster de un resto alfa-alquil-beta-hidroxi-ácido graso; y (iv) un resto de lipoaminoácldo; y

(ii) R5 es hidrógeno o la cadena lateral de un resto de aminoácido.

8. El lipopéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el resto lipídico está separado del resto peptídico por un espaciador.

9. El lipopéptido de la reivindicación 8, en el que el espaciador comprende arginina, serina o ácido 6- aminohexanoico.

1. El lipopéptido de la reivindicación 9 ó 1, en el que el espaciador consiste en un homodlmero de serina.

11. El lipopéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 1, en el que el resto de Usina Interna está anidado dentro de una secuencia de aminoácidos sintética que tiene baja inmunogenicidad.

12. El lipopéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que el epítopo de linfocitos T auxiliares es un epítopo de linfocitos T auxiliares de hemaglutinina del virus de la gripe, o un epítopo de linfocitos T auxiliares de la proteína F del virus del moquillo canino (CDV-F).

13. El lipopéptido de la reivindicación 12, en el que el epítopo de linfocitos T auxiliares de hemaglutinina del virus de la gripe comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID NO: 1.

14. El lipopéptido de la reivindicación 12, en el que el epítopo de linfocitos T auxiliares de la proteína CDV-F comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID NO: 2.

15. El lipopéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que el epítopo de CTL procede de una proteína inmunógena, lipoproteína, o glicoproteína de un virus.

16. El lipopéptido según la reivindicación 15, en el que el virus es el virus de la gripe.

17. El lipopéptido de la reivindicación 16, en el que el epítopo de CTL comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID NO: 2.

18. El lipopéptido según la reivindicación 15, en el que el virus es el virus de la hepatitis C.

19. El lipopéptido de la reivindicación 18, en el que el epítopo de CTL comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID NO: 176.

2. El lipopéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que el epítopo de CTL procede de una proteína Inmunógena, lipoproteína, o glicoproteína de un organismo procariota.

21. El lipopéptido según la reivindicación 2, en el que el epítopo de CTL procede de Listeria monocytogenes.

22. El lipopéptido de la reivindicación 21, en el que el epítopo de CTL comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID NO: 172.

23. El lipopéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que el epítopo de CTL procede de una protelna ¡nmunógena, llpoprotelna, o glicoprotelna de un organismo eucariota.

24. El lipopéptido según la reivindicación 23, en el que el organismo eucariota es un parásito.

25. El lipopéptido según la reivindicación 23, en el que el organismo eucariota es un mamífero.

26. El lipopéptido según la reivindicación 25, en el que el epítopo de CTL procede de una proteína de ovoalbúmina de un mamífero o de una célula tumoral.

27. El lipopéptido según la reivindicación 26, en el que el epítopo de CTL comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID NO: 173.

28. El lipopéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 27, en el que el polipéptldo comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 4, SEC ID NO: 174, SEC ID NO: 175 y SEC ID NO: 177.

29. El lipopéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 28, capaz de aumentar la expresión superficial de moléculas del MHC clase II en células dendríticas (DC) inmaduras.

3. El lipopéptido de la reivindicación 29, en el que DC son células D1.

31. Un lipopéptido que comprende un polipéptido conjugado con uno o más restos lipidíeos, en el que:

(i) dicho polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que comprende:

(a) la secuencia de aminoácidos de un epítopo de linfocitos T auxiliares (Th) y la secuencia de aminoácidos de un epítopo de CTL, en el que dichas secuencias de aminoácidos son diferentes; y

(b) un resto de Usina interna para la unión covalente de cada uno de dichos restos lipidíeos a través del grupo amino en épsilon de dicho resto de lisina;

(¡i) cada uno de dicho uno o más restos lipidíeos se une covalentemente al polipéptido a través de un grupo amino en épsilon de dicho resto de lisina interna; en el que el resto de lisina interna al que se une el resto lipídico está localizado entre el epítopo de Th y el epítopo de CTL; y

(iii) dicho lipopéptido tiene la Fórmula General (VI):

Fórmula (VI):

epítopo } A NH CH CO. A

Jh 2)n

J

I

Y

epítopo

en la que:

epítopo es un epítopo de linfocitos T auxiliares o epítopo de CTL;

A o bien está presente o bien está ausente, y consiste en un espaciador de aminoácidos de alrededor

de 1 a alrededor de 6 aminoácidos de longitud;

n es 4;

X es NH;

Y o bien está presente o bien está ausente, y consiste en un espaciador de aminoácidos de alrededor

de 1 a alrededor de 6 aminoácidos de longitud; y

Z es un resto lipídico.

32. El lipopéptido de la reivindicación 31, en el que A está ausente.

33. El lipopéptido de la reivindicación 31 ó 32, en el que Y está presente, y consiste en un homodímero de serina.

34. El lipopéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 31 a 33, en el que Z se selecciona del grupo que 5 consiste en: Parn-iCys, Panr^Cys, Parri3Cys, ChoLLys, Ste2Cys, Lau2Cys, y OcÍ2Cys.

35. El lipopéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 31 a 34, capaz de aumentar la expresión superficial de moléculas del MHC clase II en células dendríticas (DC) Inmaduras.

36. El lipopéptido de la reivindicación 35, en el que DC son células D1.

37. Una composición farmacéutica para provocar una respuesta de linfocitos T cltotóxicos frente a un epítopo de 1 CTL en un sujeto, comprendiendo la composición un lipopéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 36.

38. La composición farmacéutica según la reivindicación 37, en la que el lipopéptido es para administración ¡ntranasal al sujeto.

39. La composición farmacéutica según la reivindicación 37, en la que el lipopéptido es para administración mediante Inyección al sujeto.

4. La composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 37 a 39, en la que el epítopo de CTL

es un epítopo de CTL de una proteína del virus de la gripe.

41. La composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 37 a 39, en la que el epítopo de CTL es un epítopo de CTL de una proteína del virus de la hepatitis C.

42. La composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 37 a 39, en la que el epítopo de CTL 2 es un epítopo de CTL de una proteína de Listeria monocytogenes.

43. La composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 37 a 39, en la que el epítopo de CTL es un epítopo de CTL específico de tumor.

44. La composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 37 a 43, en la que la composición comprende además un excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable.

45. Una vacuna que comprende el lipopéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 36.