Modelos tridimensionales de enfermedades de células/tejidos perfundidos.

Un aparato que comprende una distribución de pares aislados de biorreactor de perfusión y de depósito para cultivar células o tejido,

el aparato comprende

un colector de fluidos que comprende una distribución de pares aislados de biorreactor de perfusión y depósito para el cultivo celular o tisular, y

un colector de control que comprende canales de control común accionados en paralelo para actuar simultáneamente sobre cada par de biorreactores y depósitos,

en donde cada par fluidamente aislado, de biorreactor de perfusión y depósito, se conecta por un canal de fluido que permite la recirculación de un medio de cultivo celular,

en donde cada par, de biorreactor de perfusión y depósito, se aísla fluidamente de todos los otros pares, de biorreactores de perfusión y depósitos,

en donde cada canal de control se separa de la válvula de fluido por un diafragma de canal de fluido, definida por una membrana monolítica elastomérica emparedada que puede ser desviada a una cámara de desplazamiento de válvula por un accionamiento hidráulico o neumático que utiliza los canales de control común para hacer circular el medio a través de la distribución de pares de biorreactor y depósito por lo que las válvulas definen unas bombas para el medio de cultivo

en donde las válvulas de cada par de biorreactor y depósito se conectan en serie y en donde las válvulas de todos los biorreactores en la distribución son accionadas en paralelo a través de los canales de control común en donde el volumen del medio de cultivo celular bombeado a través del canal de fluido al biorreactor o al depósito se determina por el volumen de la cámara de desplazamiento de válvula, y

en donde cada biorreactor de perfusión comprende una estructura tridimensional desmontable de soporte de células o tejidos a través de la que se perfunde el medio de cultivo celular.

Modelos tridimensionales de enfermedades de células/tejidos perfundidos Referencia cruzada con solicitudes relacionadas Esta solicitud reivindica prioridad sobre la solicitud provisional de EE.UU. nº de serie 60/572.583 presentada en la Oficina de Patentes y Marcas de EE.UU. el 19 de mayo de 2004.

Antecedentes de la invención La presente descripción está relacionada con una distribución de biorreactores perfundidos en un formato de “placa de múltiples pocillos”, en donde cada biorreactor de la distribución consiste en una matriz a microscala sembrada con células que forma un microtejido, múltiples tejidos y/o un agregado de células y con métodos para utilizar la distribución en ensayos de alta producción, por ejemplo, para determinar el efecto de agentes biológicos y/o químicos en las distribuciones de tejido a microscala, estudiar las interacciones tejido-tejido, o para detectar la presencia de agentes biológicos y/o químicos. La invención proporciona un aparato según se define en las reivindicaciones adjuntas.

La ingeniería de tejidos ha surgido como un campo científico que tiene el potencial para ayudar en la terapia humana mediante la producción de tejidos y órganos anatómicos con la finalidad de realizar trasplantes y cirugía reconstructiva. Combina los campos científicos de la ciencia de materiales, la biología celular y molecular y la medicina para crear nuevos dispositivos para la sustitución, la reparación y la reconstrucción de tejidos y estructuras dentro del cuerpo. En la última década se han propuesto muchos planteamientos. Un planteamiento es combinar células específicas de tejido con unos armazones (scaffolds) porosos abiertos de polímero que luego pueden implantarse. Al dispositivo de polímero puede añadirse una gran cantidad de células en un cultivo celular y puede mantenerse por difusión. Después de la implantación, se produce el crecimiento hacia el sistema vascular, las células se modelan de nuevo y a medida que el polímero se degrada por hidrólisis se crea un nuevo tejido estable.

Se han descrito varios planteamientos para fabricar dispositivos de regeneración de tejido para el crecimiento de células in vitro o in vivo. Se han descrito dispositivos poliméricos para sustituir la función de órganos o proporcionar un soporte estructural. Se informó de ese tipo de métodos por parte de Vacanti, et al, Arch. Surg. 123:545-49 (1988) ; Patente de EE.UU. nº 4.060.081 de Yannas, et al.; Patente de EE.UU. nº 4.485.097 de Bell; y Patente de EE.UU. nº

4.520.821 de Schmidt, et al. En general, los métodos utilizados por Vacanti, et al., y Schmidt, et al., pueden ponerse en práctica seleccionando y adaptando composiciones existes de fibra de polímero para la implantación y el sembrado con células, mientras que los métodos de Yannas y Bell producen unas estructuras de colágeno modificado semejantes a esponjas.

Si el dispositivo tiene un grosor significativo, los dispositivos de regeneración de tejidos deben ser porosos, con los poros interconectados para permitir la penetración de las células y los tejidos. Los factores tales como el tamaño de poro, la forma y la sinuosidad pueden afectar al crecimiento hacia dentro del tejido pero son difíciles de controlar utilizando técnicas estándar de procesamiento. La patente de EE.UU. nº 5.518.680 de Cima & Cima describe el uso de técnicas de fabricación de sólidos de forma libre, especialmente impresión tridimensional de polvos de polímero, para formar matrices que pueden sembrarse con células disociadas e implantadas para formar nuevas estructuras. Son fácilmente evidentes las ventajas de los métodos de sólidos de forma libre para construir estructuras específicas de polímeros biocompatibles, sintéticos o naturales, materiales inorgánicos o compuestos de materiales inorgánicos con polímeros, en los que la estructura resultante tiene tamaños de poro, formas y orientaciones definidos, particularmente tamaño de poro y orientaciones diferentes dentro del mismo dispositivo, con más de una textura o química de superficie en sitios especificados diferentes dentro del dispositivo. Sin embargo, los dispositivos todavía tienen una limitación mayor: el crecimiento hacia dentro del tejido nuevo para formar vasos sanguíneos que sustentan a las células implantadas debe producirse en el momento correcto con respeto a la creciente densidad de células dentro de la matriz para sustentar a las células implantadas, y otros tejidos no deben encapsular ni infiltrarse en la matriz para retardar el crecimiento o destruir de otro modo a las células implantadas.

El documento PCT/US96/09344 de Massachusetts Institute of Technology y Childrens’ Medical Center Corporation describe el uso de métodos de fabricación de forma libre sólida (SFF, solid free-form fabrication) para fabricar dispositivos que permitan la regeneración de tejidos y para sembrar e implantar células para formar componentes estructurales y órganos, que además que puedan proporcionar una liberación controlada de agentes bioactivos, en donde la matriz se caracteriza por una red de pasos internos funcionalmente equivalentes a los que se producen naturalmente en el sistema vascular del tejido formado por las células implantadas, y que pueda forrarse con células endoteliales y acoplarse a vasos sanguíneos u otros conductos en el momento de implantación para formar una red dúctil o vascular a través de la matriz.

Nada de esta tecnología proporciona sin embargo unos medios para mantener el tejido in vitro, ni utiliza el tejido como una herramienta de diagnóstico o cribado. Las células colocadas en un cultivo típico in vitro generalmente pierden por lo menos alguna función fisiológica diferenciada clave que normalmente exhiben como parte de tejidos organizados en el cuerpo. De este modo, si bien las células cultivadas pueden ser adecuadas para ciertas aplicaciones, por ejemplo, en la detección de toxinas y patógenos, ciertamente fallan en otras aplicaciones, por

ejemplo, cribado de fármacos que son metabolizados por los tejidos, o fármacos que se eliminan por la interacción con un órgano complejo, no simplemente un solo tipo de célula aislada. Por ejemplo, existen modelos de infección que no son in vitro para el virus de la hepatitis B (HBV) y el virus de la hepatitis C (HCV) , presumiblemente porque los hepatocitos primarios en situaciones típicas de cultivo detienen rápidamente la expresión de los receptores, de las superficie celular, que utilizan los virus para entrar en la célula. A partir de este ejemplo de un patógeno conocido, que actualmente no se puede examinar utilizando células cultivadas, se puede inferir que los patógenos (o las toxinas) desconocidos, que a menudo utilizan la captación mediada por receptor, podrían eludir similarmente la detección en células cultivadas. Similarmente, en tales sistemas tampoco pueden probarse los fármacos que deben ser unidos por receptores específicos de células que serán captados por las células para ser activas. El metabolismo xenobiótico, que principalmente es llevado a cabo por un conjunto de enzimas en el hígado, es otra función que pierden rápidamente los hepatocitos cultivados. Aunque las enzimas hepáticas producen la mayoría de los compuestos exógenos menos tóxicos, otras moléculas (como un ejemplo común, el paracetamol, fármaco para alivio del dolor) puede llegar a ser realmente más tóxico cuando es metabolizado por el hígado. Por lo tanto es crítico tener un sistema para el cribado de fármacos que pueda imitar las condiciones in vivo.

Actualmente, los modelos que no son in vitro o los modelos de animales captan adecuadamente las respuestas complejas de los tejidos humanos a los fármacos y agentes ambientales. Por otra parte un modelo que no es in vitro capta la biología compleja de las interacciones de células tumorosas con los tejidos normales adyacentes. Cada año, muchos nuevos fármacos fallan en los ensayos clínicos iniciales debido a una toxicidad imprevista, especialmente toxicidad de hígado, o debido a no tener en cuenta como metaboliza el hígado los agentes contra los tumores. Las células hepáticas pierden rápidamente las funciones específicas del hígado cuando se colocan en un cultivo. De este modo, en el tejido hepático humano in vitro no es posible evaluar la toxicidad a largo plazo de los fármacos. Además, las fuentes de células hepáticas humanas son escasas, y no pueden satisfacer la demanda para los ensayos basados en células y tejidos en la industria farmacéutica. Además la capacidad de cultivar tejido humano proporciona la oportunidad de crear modelos de metástasis de una única célula y las primeras fases del crecimiento tumoral, proporcionando un medios para cultivar el cáncer que es difícil... [Seguir leyendo]

1. Un aparato que comprende una distribución de pares aislados de biorreactor de perfusión y de depósito para cultivar células o tejido, el aparato comprende un colector de fluidos que comprende una distribución de pares aislados de biorreactor de perfusión y depósito para el cultivo celular o tisular, y

un colector de control que comprende canales de control común accionados en paralelo para actuar simultáneamente sobre cada par de biorreactores y depósitos,

en donde cada par fluidamente aislado, de biorreactor de perfusión y depósito, se conecta por un canal de fluido que permite la recirculación de un medio de cultivo celular,

en donde cada par, de biorreactor de perfusión y depósito, se aísla fluidamente de todos los otros pares, de biorreactores de perfusión y depósitos,

en donde cada canal de control se separa de la válvula de fluido por un diafragma de canal de fluido, definida por una membrana monolítica elastomérica emparedada que puede ser desviada a una cámara de desplazamiento de válvula por un accionamiento hidráulico o neumático que utiliza los canales de control común para hacer circular el medio a través de la distribución de pares de biorreactor y depósito por lo que las válvulas definen unas bombas para el medio de cultivo en donde las válvulas de cada par de biorreactor y depósito se conectan en serie y en donde las válvulas de todos los biorreactores en la distribución son accionadas en paralelo a través de los canales de control común en donde el volumen del medio de cultivo celular bombeado a través del canal de fluido al biorreactor o al depósito se determina por el volumen de la cámara de desplazamiento de válvula, y

en donde cada biorreactor de perfusión comprende una estructura tridimensional desmontable de soporte de células o tejidos a través de la que se perfunde el medio de cultivo celular.

2. El aparato de la reivindicación 1 en donde la estructura de soporte tridimensional de células o tejidos es o incluye un armazón o portador formados por un método seleccionado del grupo que consiste en la tecnología convencional de procesamiento de silicio, tal como la fotolitografía, ataque químico húmedo, ataque químico profundo iónico reactivo, micromecanizado, mecanizado por descarga de electrones, moldeo por inyección con reacción, moldeo por inyección de termoplástico, micromoldeo, punzonado, tecnologías de sólidos de forma libre, micromoldeo, repujado, taladrado con láser y mecanizado con haz de electrones.

3. El aparato de la reivindicación 1 en donde la estructura tridimensional de soporte de células/tejidos se hace de material poroso.

4. El aparato de la reivindicación 1 en donde la estructura de soporte de células/tejidos se forma por una distribución de microcanales en una película u hoja sólidas soportadas por una membrana o filtro microporosos.

5. El aparato de la reivindicación 1 en donde todos los pares de biorreactor/depósito en la distribución se cubren con una tapa común desmontable.

6. El aparato de la reivindicación 1 que comprende un dispositivo para el pipeteo manual o robótico de siembra de células/tejidos, adición de agente o recogida de muestras.

7. El aparato de la reivindicación 1 en donde el medio de cultivo celular en múltiples biorreactores se bombea por el accionamiento secuencial de las válvulas conectadas en serie.

8. El aparato de la reivindicación 1 que comprende además un primer conjunto de células.

9. El aparato de la reivindicación 8 que comprende además un segundo conjunto de células introducido después de que se establezca el tejido inicial de biorreactor.

10. El aparato de la reivindicación 9 en donde el segundo conjunto de células son células tumorales.

11. El aparato de la reivindicación 9 en el que el segundo conjunto de células son células madre.

12. El aparato de la reivindicación 8 que comprende células tumorales que crecen en el ambiente del tejido hepático.

13. El aparato de la reivindicación 8 que comprende células tumorales que pueden estudiarse en cuanto a conductas de células tumorales.

14. El aparato de la reivindicación 9 en donde los sucesos moleculares pueden visualizarse durante el crecimiento de las células tumorales.

15. El aparato de la reivindicación 8 en donde el primer conjunto de células puede modificarse antes o después de la introducción en el aparato.

16. El aparato de la reivindicación 1 que comprende células tumorales primarias de pacientes para pruebas de diagnóstico y pronóstico.

17. El aparato de la reivindicación 16 en donde las células tumorales pueden evaluarse en cuanto a su sensibilidad a un agente o terapia génica.

18. El aparato de la reivindicación 12 en donde la sensibilidad de las células tumorales a un agente o a terapia 10 génica se vinculan al metabolismo, que hace el hígado, de un agente o terapia génica.

19. El aparato de la reivindicación 11 en donde el segundo conjunto de células introducidas son células madre o progenitoras, y las células madre o progenitoras son inducidas por el tejido maduro para diferenciarse.

20. El aparato de la reivindicación 8 que comprende células maduras que se pueden inducir para reproducirse mediante la manipulación de los caudales o los componentes del medio en el sistema.