Métodos y composiciones que utilizan polipéptidos de fusión Klotho-FGF.

Un polipéptido de fusión, el cual comprende:

(a) un polipéptido que comprende al menos un subdominio extracelular de una proteína Klotho;

y

(b) un polipéptido que comprende un factor de crecimiento de fibroblastos, en donde (i) la proteína Klotho es alfa-Klotho y el factor de crecimiento de fibroblastos es el factor de crecimiento de fibroblastos 23 o la variante del factor de crecimiento de fibroblastos 23 (R179Q).

Métodos y composiciones que utilizan polipéptidos de fusión Klotho-FGF

1. Antecedentes El gen alfa-Klotho codifica una proteína transmembrana tipo l de una sola pasada de 130 kDa con un dominio extracelular y un dominio citoplasmático corto. EI dominio extracelular de Ia proteína alfa-Klotho comprende dos subdominios denominados como KL-D1 y KL-D2. Estos dos subdominios comparten homología de secuencia con la β-glucosidasa de bacterias y plantas. El dominio extracelular de la proteína alfa-Klotho se puede enlazar a la superficie de la célula mediante el dominio transmembrana o se puede escindir y liberar dentro del medio extracelular. La escisión del dominio extracelular parece ser facilitado por las bajas concentraciones extracelulares locales de Ca2+ .

Además de aIfa-Klotho, se ha identificado un homólogo de alfa-Klotho, beta-Klotho, (Ito y colaboradores, Mech. Dev.

98: 115 -9 (2000) ) . Beta-Klotho también es una proteína transmembrana tipo l de una sola pasada con los subdominios extracelulares KL-D1 y KL-D2.

Se ha demostrado que la modulación de la expresión de alfa-Klotho produce características relacionadas con el envejecimiento en mamíferos. Ratones homocigóticos para una mutación de pérdida de función en el gen alfa-Klotho desarrollan características que se parecen al envejecimiento humano, incluyendo un período de vida más corto, atrofia de la piel, pérdida de masa muscular, arterioesclerosis, enfisema pulmonar, y osteoporosis (Kuro-o y colaboradores, Nature, 390: 45 -51 (1997) ) . En contraste, la sobreexpresión del gen alfa-Klotho en ratones extiende el período de vida y aumenta Ia resistencia al estrés oxidativo en relación con los ratones de tipo silvestre (Kurosu y colaboradores, Science 309: 1829 -1833 (2005) ; Yamamoto y colaboradores, J. Biol. Chem. 280: 38029 -38034 (2005) ) . Las posibles aplicaciones médicas de Klotho y la participación de Klotho en el metabolismo de la vitamina D y minerales ha sido revisado por Ureña-Torres y colaboradores (Kidney International (2007) 71, 730 -737) .

Los factores de crecimiento de fibroblastos (los FGF) constituyen una familia de factores de crecimiento de polipéptidos homólogos expresados en muchos organismos (Ornitz e Itoh, Genome Biol. 2: revisiones, 3005.1 3005.12 (2001) ) . Entre las especies de vertebrados, los FGF están altamente conservados tanto en la estructura del gen como en la secuencia de aminoácidos, con una identidad de aminoácidos entre 13 al 71% entre sí. En los seres humanos, existen 22 miembros conocidos de la familia del FGF (FGF15 es el ortólogo de ratón del FGF19 humano, y, por consiguiente, no existe FGF15 humano) . Durante el desarrollo temprano, los FGF regulan la proliferación, migración, y diferenciación celular, pero en el organismo adulto, los FGF mantienen la homeostasis, actúan en la reparación del tejido, y responden a lesiones.

Los FGF funcionan como factores de crecimiento mediante el enlace, y por lo tanto la activación de los receptores del FGF de la superficie de la célula. Los receptores del FGF (FGFR) son receptores de tirosina quinasa que activan la transducción de la señal a través de la autofosforilación del FGFR, la fosforilación del FRS2 (sustrato 2 del receptor del FGF) y ERK1/2 (proteína quinasa 1/2 regulada por una señal extracelular) , y la activación de Egr-1 (respuesta de crecimiento temprano 1) . Los FGF también tienen una alta afinidad por los proteoglicanos de sulfato de heparina. Cuando se enlazan con los FGF, el sulfato de heparina mejora la activación de los FGFR.

Estudios recientes han demostrado características biológicas sorprendentemente similares entre ratones deficientes en FGF23 y ratones deficientes en aIfa-Klotho (Shimada y colaboradores, J. Clin. lnvest. 113: 561 -568 (2004) ; Yoshida y colaboradores, Endocrinology 143: 683 -689 (2002) ) , lo que indica una interferencia funcional entre FGF23 y aIfa-Klotho. Estos estudios condujeron a la identificación de alfa-Klotho como un compañero obligatorio de FGF23, en términos tanto de enlace como de señalización a través de sus receptores del FGF similares (Urakawa y colaboradores, Nature 22: 1524 -6 (2007) ) . El gen alfa-Klotho se expresa principalmente en riñón, glándula paratiroidea, y plexo coroideo. Se plantea la hipótesis de que la expresión específica en el tejido de alfa-Klotho restringe la activación de la señalización de FGF23 para estos tejidos.

De una manera similar a FGF23/alfa-Klotho, beta-Klotho es un compañero obligatorio de FGF19 y FGF21, tanto en el enlace como en la señalización a través de sus receptores del FGF similares respectivos (Ogawa y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 104: 7432 -7 (2007) ; Lin y colaboradores, J. Biol Chem. 282: 27227 -84 (2007) ; y Wu y colaboradores, J. Biol. Chem. 282: 29069 -72 (2007) ) . Estos estudios también han demostrado el involucramiento de beta-Klotho en la regulación de Ia actividad metabólica específica del tejido. Inicialmente se demostró que beta-Klotho actúa con FGF21 como un cofactor para regular el metabolismo de carbohidratos y lípidos en el tejido adiposo. Beta-Klotho en conjunto con FGF19 regula el metabolismo del ácido biliar en el hígado, explicando por consiguiente la elevada síntesis de bilis en los ratones deficientes en beta-Klotho (Ito y colaboradores, J Clin Invest. Agosto 2005; 115 (8) : 2202 -8) .

La patente de los Estados Unidos No. 6.579.850 describe polipéptidos y composiciones que comprenden un polipéptido alfa-Klotho. Se divulgan polipéptidos aIfa-Klotho humanos y de ratón. La patente también da a conocer que las composiciones que comprenden los polipéptidos son útiles en el tratamiento de un síndrome que se parece al envejecimiento prematuro, en el tratamiento de enfermedades de adultos, y en la supresión del envejecimiento.

La patente de los Estados Unidos No. 7.223.563 describe ácidos nucleicos aislados que codifican la secuencia del polipéptido FGF23, o células recombinantes que comprenden este ácido nucleico aislado. La patente se refiere además a métodos de diagnóstico y tratamiento de trastornos hipofosfatémicos e hiperfosfatémicos, osteoporosis, dermatomiositis, y arteriopatía coronaria.

La patente de los Estados Unidos No. 7.259.248 describe ácidos nucleicos aislados que codifican la secuencia del polipéptido FGF21. La patente se refiere además a métodos de diagnóstico y el tratamiento de una enfermedad hepática, condiciones relacionadas con la función tímica, y métodos de tratamiento de condiciones de los testículos.

2. Resumen de la invención La presente invención se refiere a polipéptidos de fusión Klotho. Los polipéptidos de fusión Klotho de Ia presente invención se forman a partir de una proteína Klotho o un fragmento activo de la misma y un factor de crecimiento de fibroblastos 23 o un fragmento activo del mismo.

Se divulgan además un polipéptido de fusión que tiene al menos un subdominio extracelular de una proteína Klotho y un factor de crecimiento de fibroblastos o un fragmento activo del mismo. EI dominio extracelular de Klotho se puede derivar a partir de cualquiera de las isoformas alfa o beta Klotho. El componente del FGF del polipéptido de fusión Klotho se describe primordialmente con referencia al factor de crecimiento de fibroblastos 19, al factor de crecimiento de fibroblastos 21, y al factor de crecimiento de fibroblastos 23. El lector de la presente solicitud puede asumir que cada uno de cada combinación del dominio extracelular alfa o beta con cada proteína del FGF humano o un fragmento activo de la misma son individualmente y específicamente contemplados.

De acuerdo con la presente invención, el dominio extracelular de la proteína Klotho puede incluir uno o ambos de los dominios KL-D1 y KL-D2 de una proteína alfa Klotho. En algunas forma de realizaciones, el polipéptido de fusión alfa-Klotho de la invención tiene al menos dos subdominios extracelulares. Por ejemplo, los dos subdominios extracelulares pueden ser dos dominios KL-D1 en repeticiones en tándem, dos dominios KL-D2 en repeticiones en tándem, o un dominio KL-D1 y un dominio KL-D2. En una forma de realización, el polipéptido de fusión de la invención comprende los aminoácidos 28 a 292 de la proteína alfa-Klotho de longitud completa.

De acuerdo con la presente invención, un polipéptido que comprende al menos un subdominio extracelular de una proteína alfa Klotho y un FGF-23 o un fragmento activo del mismo se pueden enlazar entre si de una manera covalente, por ejemplo, se pueden enlazar o fusionar químicamente en el marco mediante un enlace peptídico. También se pueden enlazar por medio de un enlazador. Los ejemplos no limitantes del enlazador de polipéptidos son las SEQ ID NOs: 11, 12, 13, 14,... [Seguir leyendo]

1. Un polipéptido de fusión, el cual comprende: (a) un polipéptido que comprende al menos un subdominio extracelular de una proteína Klotho; y (b) un polipéptido que comprende un factor de crecimiento de fibroblastos, en donde (i) la proteína Klotho es alfa-Klotho y el factor de crecimiento de fibroblastos es el factor de crecimiento de fibroblastos 23 o la variante del factor de crecimiento de fibroblastos 23 (R179Q) .

2. El polipéptido de fusión de Ia reivindicación 1, en donde el polipéptido de (a) y el polipéptido de (b) se conectan mediante un enlazador de polipéptido.

3. El polipéptido de fusión de Ia reivindicación 2, en donde el enlazador de polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID No: 16, SEQ ID NO: 17, y SEQ ID NO: 18.

4. EI polipéptido de fusión de la reivindicación 2, en donde el enlazador de polipéptido comprende al menos 1 y hasta aproximadamente 30 repeticiones de una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID No: 17, y SEQ ID NO: 18.

5. El polipéptido de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 1 -4, en donde el polipéptido de (a) es el dominio extracelular de la proteína alfa-Klotho.

6. El polipéptido de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 1 -5, en donde el subdominio extracelular de la proteína alfa-Klotho es un dominio KL-D1 o un dominio KL-D2.

7. EI polipéptido de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 1 -6, en donde el polipéptido de (a) comprende al menos dos subdominios extracelulares de la proteína alfa-Klotho.

8. El polipéptido de fusión de la reivindicación 7, en donde los dos subdominios extracelulares de Ia proteína alfa-Klotho son dos dominios KL-D1 en repeticiones en tándem, o en donde los dos subdominios extracelulares de la proteína alfa-Klotho son dos dominios KL-D2 en repeticiones en tándem.

9. El polipéptido de fusión de Ia reivindicación 7, en donde los dos subdominios extracelulares de la proteína alfa-Klotho son un dominio KL-D1 y un dominio KL-D2.

10. El polipéptido de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 1 -9, el cual comprende además un péptido de señal.

11. EI polipéptido de fusión de la reivindicación 10, en donde el péptido de señal es el péptido de señal alfa-Klotho.

12. El polipéptido de fusión de la reivindicación 10, en donde el péptido de señal es el péptido de señal IgG.

13. El polipéptido de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 1 -12, que se enlaza específicamente a un receptor del factor de crecimiento de fibroblastos.

14. EI polipéptido de fusión de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 -15, el cual comprende una secuencia de aminoácidos que es 95% o más, idéntica a Ia secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de Ia SEQ ID NO: 19. SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 40 y SEQ ID NO: 41.

15. EI polipéptido de fusión de la reivindicación 1, el cual tiene la secuencia de aminoácidos de Ia SEQ ID NO: 19.

16. El polipéptido de fusión de la reivindicación 1, el cual tiene la secuencia de aminoácidos de Ia SEQ ID NO: 20.

17. El polipéptido de fusión de la reivindicación 1, el cual tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 40.

18. EI polipéptido de fusión de Ia reivindicación 1, el cual tiene Ia secuencia de aminoácidos de Ia SEQ ID NO: 41.

19. El polipéptido de fusión de Ia reivindicación 1, el cual comprende una secuencia de aminoácidos que es 95% o más, idéntica a la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las secuencias expuestas en Ia SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 35.

20. Una composición farmacéutica, la cual comprende el polipéptido de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 1 -19 y un portador farmacéuticamente aceptable.

21. Un ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica el polipéptido de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 1 -19.

22. Una célula huésped que contiene el ácido nucleico de la reivindicación 21.

23. Un vector que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 21.

24. Un polipéptido de fusión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 -19 para uso en el tratamiento o la prevención de una condición relacionada con la edad en un individuo, que comprende administrar a un individuo que requiera del mismo una dosis terapéuticamente efectiva de una composición farmacéutica que comprende dicho polipéptido de fusión.

25. Un polipéptido de fusión de acuerdo con la reivindicación 24 para uso en el tratamiento o la prevención de una condición relacionada con la edad en un individuo, en donde la condición relacionada con la edad se selecciona del grupo que consiste de sarcopenia, pérdida de masa muscular.

26. El polipéptido de fusión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 -19, en donde Ia proteína Klotho es una proteína Klotho humana.

27. La composición farmacéutica de Ia reivindicación 20, Ia cual comprende además heparina.

28. EI polipéptido de fusión de acuerdo con cualquiera de las reivindicacione.

24. 25, para uso en el tratamiento o la prevención de una condición relacionada con la edad en un individuo, el cual comprende además administrar una dosis terapéuticamente efectiva de heparina.

29. EI polipéptido de fusión de acuerdo con cualquiera de las reivindicacione.

24. 25 o 28, para uso en el tratamiento o la prevención de una condición relacionada con la edad en un individuo, en donde dicho individuo es un humano.

30. EI polipéptido de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 1 -19 y 26, para uso en medicina.

31. EI polipéptido de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 1 -19 y 26, para uso en el tratamiento o en la prevención de atrofia muscular.

32. Una composición farmacéutica que comprende: un polipéptido de la reivindicación 1 para uso en el tratamiento o la prevención de una enfermedad o trastorno en un individuo.

Figura 2 Secuencia de ácido nucleico de Klotho humano (NM_004795) (SEQ ID NO: 1)

Región de codificación de la proteína.

9. 3047

Secuencia de aminoácidos de Klotho (NP_004786) (SEQ ID NO: 2)

Secuencia de ácido nucleico de beta-Klotho (NM_175737) (SEQ ID NO: 3)

Región de codificación de la proteína.

9. 3232

Secuencia de aminoácidos de beta-Klotho (NP-783864) (SEQ ID NO: 4)

Secuencia de aminoácidos del dominio 1 de Klotho humano (KL-D1) (SEQ ID NO: 5)

Secuencia de aminoácidos del dominio 2 de Klotho humano (KL-D2) (SEQ ID NO: 6)

Secuencia de aminoácidos del dominio extracelular de Klotho (sin péptido de señal) (SEQ ID NO: 7) Secuencia de aminoácidos del péptido señal de Klotho (SEQ ID NO: 8)

Secuencia de aminoácidos del péptido señal de IgG (SEQ ID NO: 9)

Secuencia de ácido nucleico del enlazador de polipéptido (Gly4 Ser) 3 (SEQ ID NO: 10)

Secuencia de aminoácidos del enlazador de polipéptido (Gly4 Ser) 3 (SEQ ID NO: 11)

Secuencia de aminoácidos del enlazador de polipéptido (Gly4 Ser) (SEQ ID NO: 12)

Secuencia de aminoácidos del enlazador de polipéptido (Gly) (SEQ ID NO: 13)

Secuencia de aminoácidos del enlazador de polipéptido (Gly Gly) (SEQ ID NO: 14)

Secuencia de aminoácidos del enlazador de polipéptido (Gly Ser) (SEQ ID NO: 15)

Secuencia de aminoácidos del enlazador de polipéptido (Gly2 Ser) (SEQ ID NO: 16) Secuencia de aminoácidos del enlazador de polipéptido (Ala) (SEQ ID NO: 17)

Secuencia de aminoácidos del enlazador de polipéptido (Ala Ala) (SEQ ID NO: 18)

Secuencia de aminoácidos del FGF23 (R179Q) -del dominio extracelular de Klotho -del péptido señal de Klotho (SEQ ID NO: 19)

Secuencia de aminoácidos del FGF23 (R179Q) -del dominio extracelular de Klotho -del péptido señal de IgG (SEQ ID NO: 20)

Secuencia de aminoácidos de KL-D1-FGF23 (R179Q) (SEQ ID NO: 21)

Secuencia de aminoácidos de KL-D2-FGF23 (R179Q) (SEQ ID NO: 22)

Secuencia de aminoácidos de (KL-D1) 2-FGF23 (R179Q) (SEQ ID NO: 23) Secuencia de aminoácidos (KL-D2) 2-FGF23 (R179Q) (SEQ ID NO: 24)

Secuencia de aminoácidos del dominio extracelular de Klotho del FGF23 (R179Q) (SEQ ID NO: 25) Secuencia de aminoácidos de KL-D1 del FGF23 (R179Q) (SEQ ID NO: 26)

Secuencia de aminoácidos de KL-D2 del FGF23 (R179Q) (SEQ ID NO: 27) Secuencia de aminoácidos de (KL-D1) 2 del FGF23 (R179Q) (SEQ ID NO: 28)

Secuencia de aminoácidos de (KL-D2) 2 del FGF23 (R179Q) (SEQ ID NO: 29)

Secuencia de ácido nucleico de FGF19 (NM_005117) (SEQ ID NO: 30)

Región de codificación de la proteína (464-1114)

Secuencia de aminoácidos de FGF19 (NM_005108) (SEQ ID NO: 31)

Secuencia de ácido nucleico de FGF21 (NM_019113) (SEQ ID NO: 32)

Región de codificación de la proteín.

15. 780

Secuencia de aminoácidos de FGF21 (NP_061986) (SEQ ID NO: 33)

Secuencia de ácido nucleico de FGF23 (NM_020638) (SEQ ID NO: 34)

Región de codificación de la proteín.

14. 902

Secuencia de aminoácidos de FGF23 (NP_065689) (SEQ ID NO: 35)

Secuencia de aminoácidos de FGF23 (R179Q) (SEQ ID NO: 36)

Secuencia de aminoácidos del dominio 1 de beta-Klotho humano (b-KL-D1) (SEQ ID NO: 37)

Secuencia de aminoácidos del dominio 2 de beta-Klotho humano (b-KL-D2) (SEQ ID NO: 38)

Secuencia de aminoácidos del dominio extracelular de beta-Klotho humano (sin péptido de señal) (SEQ ID NO: 39)

Secuencia de aminoácidos del FGF23 del péptido señal sin sKlotho (sin péptido de señal) (SEQ ID NO: 40)

Secuencia de aminoácidos del FGF23 (R179Q) del péptido señal sin sKlotho (sin péptido de señal) (SEQ ID NO: 41)

Péptido señal sin FGF23 (SEQ ID NO: 42)

Péptido señal sin FGF23 (R179Q) (SEQ ID NO: 43) Péptido señal Klotho con sKlotho (SEQ ID NO: 44)

Péptido señal de IgG con sKlotho (SEQ ID NO: 45)