Métodos para transformar levaduras.

Un método de preparación de una biblioteca de levaduras mediante electroporación de células de levadura,

comprendiendo el método las etapas de:

incubar las células de levadura en una solución que comprende LiAc de 0,01 a 1,0 M y DTT de 1 a 100 mM, y proporcionar una suspensión que comprende ADN de vectores, ADN del inserto, las células de levadura, sorbitol de 0,1 a 10 M y CaCl2 o MgCl2 de 0,1 a 10 mM y

electroporar la suspensión a 0,5 kV /cm a 12,5 kV/cm con una capacitancia de 10 a 50 μF.

Métodos para transformar levaduras Solicitud relacionada

Esta solicitud reclama prioridad y beneficio con respecto a la solicitud provisional de Estados Unidos N° 61/67.91 presentada el 3 de marzo de 28.

Campo de la invención

La invención se refiere a los campos de la transformación de levaduras y células de levaduras y bibliotecas de células de levaduras transformadas de este modo y a la producción de productos recomblnantes de las mismas. Más específicamente, la presente Invención se refiere a la transformación de levaduras mediante electroporaclón.

Antecedentes de la invención

Los anticuerpos terapéuticos generados usando Inmunizaciones animales ¡n vivo o mediante tecnología de expresión de anticuerpos recombinantes in vitro han tenido éxito en la clínica y como tales se han validado estas tecnologías como técnicas eficaces de descubrimiento de fármacos. Aunque normalmente se espera que los anticuerpos monoclonales derivados de inmunizaciones animales tengan una afinidad suficientemente alta como alcanzar una eficacia terapéutica, el desarrollo de anticuerpos terapéuticos de inmunizaciones animales requiere la humanización de los anticuerpos no humanos o el acceso a animales transgénicos que expresan anticuerpos humanos. La selección directa de anticuerpos completamente humanos a partir de bibliotecas de anticuerpos preestablecidas mediante tecnologías de expresión in vitro (expresiones en fagos, bacterias, levaduras, células de mamífero y ribosomas) (Chao, G. et al. (26) Nat. Protoc. 1:755-68; Gai, S. A. y Wittrup, K. D. (27) Curr. Opin. Struct. Biol. 17:467-73; Griffiths, A. D. et al. (1994) EMBO J. 13:3245-6; He, M. y Khan, F. (25) Expert Rev. Proteomics 2:421-3; Hoogenboom, H. R. (22) Methods Mol. Biol. 178:1-37; Hoogenboom, H. R. (25) Nat. Biotechnol. 23:115-16) ofrece un valioso abordaje paralelo y puede presentar la mejor alternativa en los casos en los que el antígeno diana no logra producir una respuesta ¡nmunitaria productiva in vivo.

Las bibliotecas de anticuerpos humanos se han modificado para que expresen anticuerpos de longitud completa o varios fragmentos de anticuerpos tales como Fab, scFv y dAb. Generalmente, las bibliotecas se construyen capturando y transfiriendo diversidades de anticuerpos de repertorios de linfocitos B en la biblioteca con o sin la introducción adicional de diversidad sintética (Hoet, R. M. et al. (25) Nat. Biotechnol. 23:344-8), o aleatorlzando sintéticamente residuos de CDR en armazones de anticuerpos humanos limitados (Rothe, C. et al. (28) J. Mol. Biol. 376:1182-2). Dado que las cadenas pesadas y ligeras de los anticuerpos se amplifican por separado y se reformatean en el formato de expresión de la biblioteca, se forman nuevos apareamientos entre VH y VL durante este proceso. Aunque este barajado de VH-VL permite la creación de nuevos sitios de antígeno, también aumenta muy significativamente la diversidad de la biblioteca teórica. Se han desarrollado varias estrategias para modificar mejor y hacer más productivas las bibliotecas de anticuerpos reduciendo la diversidad de la biblioteca teórica y el tamaño de la biblioteca real requerido para la obtención eficaz de muestras de la biblioteca. Estas estrategias incluyen el diseño inteligente de bibliotecas sintéticas o semisintéticas (Rothe, C. et al. (28) J. Mol. Biol. 376:1182- 2) y bibliotecas inmunológicas (Hoet, R. M. et al. (25) Nat. Biotechnol. 23:344-8) o pseudoinmunológicas (Lee, H. W. et al. (26) Biochem. Biophys. Res. Commun. 346:896-93) generadas a partir de repertorios de linfocitos C menos diversos pero potencialmente más reactivos. Aunque estos abordajes pueden ser eficaces en la reducción significativa de la diversidad de la biblioteca teórica mediante diversos o incluso muchos registros, la necesidad de tamaños grandes de bibliotecas y de métodos para generarlos siempre complementará los diseños de las bibliotecas con el fin de aumentar las posibilidades de identificar estas coincidencias de anticuerpos con independencia de su escasez.

La disponibilidad de medios para la producción de bibliotecas de ácidos nucleicos y productos recomblnantes producidos de este modo, dichas proteínas farmacéuticas, en sistemas eucariotas tales como levaduras, proporciona ventajas significativas con respecto al uso de sistemas procariotas, tales como E. coli. Generalmente, las levaduras pueden crecer ha densidades celulares más altas que las bacterias y son fácilmente adaptables a procesos de fermentación continua. No obstante, el desarrollo de especies de levaduras como sistemas de huésped/vector para la producción de productos recomblnantes y bibliotecas se ve gravemente dificultado por la falta de conocimientos sobre las condiciones de transformación y sobre los medios adecuados para Introducir de forma estable ácidos nucleicos extraños en la levadura célula huésped.

Entre los diversos parámetros eléctricos y biológicos que facilitan la electrotransformación de células se encuentra la adsorción de ADN en la superficie celular. Campos eléctricos alternos de intensidad baja también estimulan la transferencia del ADN a las bacterias de E. coli, posiblemente mediante la estimulación eléctrica de las ADN permeasas. Se han acumulado datos del efecto dominante de electrodifusión y electroforético sobre la transferencia génica electroporativa del ADN polielectrolltos. También se han notificado efectos electroosmóticos e invaginación de membrana mediante electroporación.

La aplicación de un campo eléctrico a través de la membrana celular de la levadura tiene como resultado la creación de poroso temporales que son cruciales para el proceso de electroporación. Un generador de señal de electroporación proporciona la tensión (en kV) que viaja a través del hueco (en cm) entre los electrodos. Esta potencial diferencia define lo que se denomina la fuerza del campo eléctrico, donde E equivale a kV/cm. Cada célula tiene su propia fuerza de campo crítica para una electroporación óptima. Esto se debe al tamaño de la célula, la formación de la membrana y las características individuales de la propia pared celular. Por ejemplo, normalmente las células de mamífero requieren entre ,5 y 5, kV/cm antes de que se produzca la muerte celular y/o la electroporación. En general, la fuerza del campo necesaria varía de forma inversa con el tamaño de la célula.

Métodos de transformación

1. Transformación mediante electroporación

Becker et al. (Methods in Enzymology 194: 182-187 (1991)) divulgan métodos de transformación de la levadura Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae). Becker también divulga la transformación de esferoplastos.

Faber et al. (Curr. Genet. 25: 35-31 (1994)) divulgan métodos para la transformación de la levadura metllotróplca Hansenula polymorpha. Faber también aplicó el método a Pichia methanolica.

Helmuth et al. (Analytical Biochem. 293:149-152 (21)) divulgan una eficiencia Incrementada de la transformación de levaduras combinando los pretratamientos con LiAc y DTT.

Kasutske et al. (Yeast 8: 691-697 (1992)) divulgan transformación por electropulsos de células intactas de Candida maltosa mediante diferentes plásmidos vectores homólogos.

Meilhoc et al. (Bio/Technology 8: 223-227 (199)) divulgan un sistema de transformación usando células intactas de la levadura S. cerevisiae y pulsos del campo eléctrico.

Neumann et al. (1996) Biophys. J. (1996) 71:868-877 divulgan la cinética de la transformación de las células de levadura mediante electroporación y adsorción de ADN mediada por calcio.

Plredda et al. (Yeast 1: 161-1612 (1994)) divulgan un sistema de transformación para la levadura Yamadazyma (Pichia) ohmeri.

Scorer et al. (Bio/Technology 12: 181-184 (1994)) divulgan vectores de P. pastoris que permiten la rápida selección de G418 de transformantes con un número de copias raramente alto para la expresión en Pichia pastoris usando los sistemas tanto de electroporación como de transformación de esferoplastos.

Sherman et al. (Laboratory Course Manual for Methods in Yeast Genetics, páginas 91 12, Coid Spring Harbor Laboratory (1986)) divulgan la transformación de mutantes de levaduras LEU2 e HIS3.

Suga y Hatakeyama (Curr. Genet. 43:26-211 (23)) divulgan un método de congelación para generar células competentes antes de la electroporación con adición de calcio.

Thompson et al. (Yeast 14:565-571 (1998)) divulgan la preparación de células de levadura tales como S. cerevisiae y Candida albicans para la transformación mediante electroporación.

Yang et al. (Applied and Environmental Microbiology 6(12): 4245-4254 (1994)) divulgan la electroporación de Pichia stipitis basada en el gen URA3 y una secuencia de replicación... [Seguir leyendo]

1. Un método de preparación de una biblioteca de levaduras mediante electroporación de células de levadura, comprendiendo el método las etapas de:

incubar las células de levadura en una solución que comprende LiAc de ,1 a 1, M y DTT de 1 a 1 mM, y proporcionar una suspensión que comprende ADN de vectores, ADN del inserto, las células de levadura, sorbitol de ,1 a 1 M y CaCI2 o MgCI2 de ,1 a 1 mM y

electroporar la suspensión a ,5 kV /cm a 12,5 kV/cm con una capacitancia de 1 a 5 pF.

2. El método de la reivindicación 1, donde la suspensión comprende sorbitol 1M y CaCI2.1 mM.

3. El método de la reivindicación 1, donde la suspensión comprende sorbitol 1M y MgCI21 mM.

4. El método de la reivindicación 1, donde las células de levadura se incuban en una solución que comprende LiAc ,1 M y DTT 1 Mm.

5. El método de la reivindicación 1, donde la suspensión se somete a electroporación a 2,5 kV/cm con una capacitancia de 25 pF.

6. El método de la reivindicación 1, donde la etapa de electroporación se realiza en una cubeta con ,2 cm de hueco.

7. El método de la reivindicación 1, donde se usa de 1 pg a 8pg del ADN del vector.

8. El método de la reivindicación 1, donde se usan 4 pg del ADN del vector.

9. El método de la reivindicación 1, donde el vector es lineal.

1. El método de la reivindicación 1, donde la suspensión comprende 4 pl of 1,6 x 19 células de levadura/ml.

11. El método de la reivindicación 1, donde la proporción entre el ADN del vector y el ADN del Inserto está en el Intervalo de 1:,5 a 1:1.

12. El método de la reivindicación 1, donde la proporción entre el ADN del vector y el ADN del inserto es de 1:3.

13. Un método para transformar levaduras con ADN para preparar una biblioteca de levaduras, comprendiendo el método las etapas de:

[[C]] cultivar células de levadura a una DC>6oo del , a 2;

[[L]] lavar las células de levadura en agua;

[[L]j lavar las células de levadura en una solución que comprende sorbitol y CaCI^

[[l]j incubar las células de levadura en una solución que comprende LiAc de ,1 a 1, M y DTT de 1 a 1 mM; [[L]] lavar las células de levadura en una solución que comprende sorbitol y CaCI^

[[R]] resuspender las células de levadura en una solución que comprende sorbitol de ,1 a 1 M y CaCI2 o MgCI2 de ,1 a 1 mM para formar una suspensión de electroporación de las células de levadura.

[[A]] añadir un volumen de la suspensión de electroporación de las células de levadura al ADN del vector y al ADN del inserto para formar una suspensión de electroporación de células de levadura - ADN; y [[E]] electroporación de la suspensión de electroporación de células de levadura - ADN a una tensión de entre 2,5 kV/cm and 12,5 kV/cm en una cubeta de hueco de ,2 cm.