Métodos para inhibir la unión de endosialina a ligandos.

Un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo que se une de manera específica a endosialina y que inhibe la interacción de la endosialina expresada en la superficie de una célula con el colágeno o la fibronectina,

para el uso en la inhibición de la neovascularización o la angiogénesis en una neoplasia en un sujeto.

Métodos para inhibir la unión de endosialina a ligandos Campo La invención se refiere en general al campo de los productos inmunoterapéuticos. De manera más específica, la invención se refiere a composiciones para la alteración de la interacción de endosialina con sus sustratos para inhibir funciones celulares, que incluyen la angiogénesis y la motilidad celular.

Antecedentes A lo largo de la memoria descriptiva se citan diversas publicaciones, que incluyen patentes, solicitudes publicadas, artículos técnicos y artículos académicos.

La angiogénesis es un proceso regulado que implica la formación de vasos sanguíneos nuevos. Desempeña un papel esencial en el crecimiento normal, el desarrollo embrionario, la cicatrización de heridas, y otros procesos fisiológicos (Yancopoulos et al. (2000) Nature, 407:242-8) . En el capilar en desarrollo, las proteínas de la matriz extracelular (ECM) sirven como armazón estructural para los tejidos endoteliales y tumorales en proliferación, y proporcionan soporte para el crecimiento de las células tumorales. La angiogénesis de novo está implicada en varios estados patológicos, que incluyen el cáncer, en los que la formación de nuevos vasos sanguíneos "similares a los embrionarios" (denominada neovascularización en la presente memoria) parece que difiere de la vasculatura normal con respecto a la estructura y la función (Hanahan et al. (2000) Cell, 100:57-70) . Varios estudios in vivo e in vitro han demostrado las diferencias biológicas entre la vasculatura normal y la vasculatura asociada a enfermedades mediante el uso de diversos sistemas de modelos de angiogénesis, lo que ha generado la posibilidad de nuevos compuestos anti-angiogénicos que pueden inhibir de manera selectiva la formación de vasos de células endoteliales de tipo embrionario asociadas a tumores para la terapia de una enfermedad neovascular. En vista de estas oportunidades para la terapia, se está llevando a cabo una búsqueda intensa de posibles objetivos que puedan inhibir de manera específica el crecimiento y la función de las células endoteliales o estromales asociadas a tumores y a otras enfermedades neovasculares (fibroblastos, pericitos, etc.) .

En un intento de identificar tales objetivos, se han diseñado estrategias para identificar los antígenos de la superficie celular del estroma tumoral así como de proteínas específicas aisladas o ARN que se expresan en las células estromales tumorales (Rettig et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:10832-6; St. Croix et al. (2000) Science, 289:1197-1202) . Estas estrategias han identificado una proteína de la superficie celular que parece expresarse de manera específica en las células estromales tumorales denominada endosialina (o marcador endotelial tumoral 1 (TEM1) o CD248) .

El examen de los patrones de expresión de genes en el tejido normal y en el neoplásico indica la estimulación de la expresión del mARN de endosialina en los neovasos tumorales. (St Croix et al. (2000) Science, 289:1197-1202) . Se observaron niveles de expresión de endosialina similares en el cáncer colorrectal humano (Rmali et al. (2005) World

J. Gastroenterol., 11:1283-1286) , tejidos de cáncer de mama (Davies et al. (2004) Clin. Exp. Metastasis, 21:31-37) , e histiocitomas (Dolznig et al. (2005) Cancer Immun., 5:10) . Se ha observado la expresión de endosialina humana en el glioblastoma sumamente invasivo, los astrocitomas anaplásicos, y los carcinomas metastásicos, que incluyen los melanomas (Brady et al. (2004) J. Neuropathol. Exp. Neurol., 63:1274-1283; Huber et al. (2006) J. Cutan. Pathol., 33:145-155) .

El uso de anticuerpos en estudios de inmunohistoquímica ha descubierto una expresión intensa de endosialina en varias células endoteliales neovasculares, fibroblastos y/o pericitos (Virgintino et al. (2007) Angiogenesis, 10:35-45) en tejidos cancerosos, mientras la expresión es limitada en líneas celulares derivadas de cultivos endoteliales similares a los embrionarios tales como, pero sin limitación, HUVEC (células endoteliales de vena umbilical humana) o HMVEC (células endoteliales microvasculares dérmicas neonatales) . El análisis de los anticuerpos, polipéptidos o ligandos no proteicos que se pueden unir a endosialina ha identificado un subgrupo de tales moléculas que pueden inhibir la capacidad de la endosialina de unirse a su sustrato y/o inhibir las actividades intracelulares que conducen a la estasis o muerte celular.

Rettig et al. describió anticuerpos monoclonales que reconocen antígenos en vasos en diversos tipos de cáncer (Rettig et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:10832-6) . Uno de estos se denominó FB5 y se generó por medio de la inmunización de ratones con fibroblastos embrionarios humanos. FB5 reconoce una proteína de ~100 kDa en la superficie de una línea celular de neuroblastoma, LA1-5s (patente de EE.UU. nº 5.342.757) . FB5 es un anticuerpo murino (IgG1) que se une a endosialina, y se ha demostrado que reconoce las células endoteliales asociadas a una diversidad de diferentes tipos de cáncer. El estudio estructural ha clasificado la endosialina como una proteína integral de membrana similar a lectina de tipo C compuesta de cinco dominios extracelulares globulares (que incluyen un dominio de lectina de tipo C, un dominio con similitud hacia el patrón Sushi/ccp/scr, y tres repeticiones de EGF) . La proteína contiene también una región similar a mucina, un segmento transmembrana, y una cola citoplasmática corta. La proteína parece ser una glicoproteína. El análisis de carbohidratos demuestra que la proteína central de endosialina tiene una abundante glicosilación con unión en O (Christian et al. (2001) J. Biol. Chem., 276:48588-48595) . El trabajo posterior combinó las regiones determinantes de la complementariedad

(CDRs) de FB5 de ratón en un esqueleto de IgG1 humana para crear un anticuerpo humanizado que se une a vasos en los tejidos cancerosos así como a un subgrupo de células en cultivos de HMVEC.

Los ratones con inactivación de Tem1 se desarrollan normalmente y exhiben una cicatrización normal de heridas, lo que sugiere que la endosialina no es necesaria para la neovascularización durante el desarrollo fetal o la reparación de heridas. (Nanda et al. (2006) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3351-3356) . Cuando se implantaron células de cáncer colorrectal en sitios abdominales de ratones con inactivación de Tem1, sin embargo, la pérdida de expresión de endosialina se correlacionó con una reducción del crecimiento tumoral, la invasión, y la metástasis en comparación con los animales originarios. Se ha demostrado que la ausencia de expresión de endosialina reduce el crecimiento, la invasión, y la metástasis de xenoinjertos de tumores humanos en un ratón con inactivación de endosialina. (Nanda et al. (2006) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3351-3356) . Además, la carencia de endosialina condujo a un incremento de vasos sanguíneos inmaduros pequeños y un número disminuido de vasos tumorales medios y grandes.

La neovascularización está asociada a varios estados patológicos. En el cáncer, se cree que la neovascularización es importante para suministrar sangre a los tumores. En las enfermedades no oncológicas o cancerosas, tales como retinopatía y degeneración macular, la neovascularización incontrolada provoca la pérdida de vista (Wilkinson-Berka (2004) Curr. Pharm. Des., 10:3331-48; Das y McGuire (2003) Prog. Retin. Eye Res., 22:721-48) . Además, varios informes han identificado un papel de la neovascularización en la enfermedad inflamatoria (Paleolog y Miotla (1998) Angiogenesis, 2 (4) :295-307) . Los métodos para entender las rutas moleculares en las células precursoras y endoteliales similares a las embrionarias, así como las células asociadas endoteliales (pericitos, fibroblastos, etc.) asociadas a estos estados patológicos conducirán al desarrollo de fármacos nuevos para tratar estas enfermedades. A la inversa, la neovascularización está asociada a la cicatrización de heridas (Galiano et al. (2004) Am. J. Pathol., 164:1935-47) . La identificación de las rutas moleculares que estimulan la vascularización para la cicatrización de heridas puede ofrecer la capacidad de identificar fármacos y factores que pueden estimular estos procesos para potenciar el tratamiento de heridas asociadas a traumatismos, quemaduras e infecciones.

Un problema difícil en la terapia eficaz antiangiogénica y proangiogénica es la naturaleza indefinida de los procesos biológicos, de las moléculas y las rutas asociadas que son importantes para activar los procesos celulares asociados a la neovascularización (Bagley et al. (2003) Cancer Res., 63:5866-73) . La capacidad de identificar y dilucidar las moléculas y su función en la regulación de una ruta... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo que se une de manera específica a endosialina y que inhibe la interacción de la endosialina expresada en la superficie de una célula con el colágeno o la fibronectina, para el uso en la inhibición de la neovascularización o la angiogénesis en una neoplasia en un sujeto.

2. Un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo para el uso según la reivindicación 1, en el que dicho anticuerpo o fragmento de unión al antígeno no se une a la endosialina murina.

3. Un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo para el uso según cualquier reivindicación precedente, en el que el valor de la afinidad de unión de dicho anticuerpo o fragmento de unión al antígeno para endosialina es menor de 1 x 10-7 M.

4. Un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo para el uso según cualquier reivindicación precedente, en el que dicho anticuerpo o fragmento de unión al antígeno es un anticuerpo quimérico o fragmento de unión al antígeno, o es un anticuerpo humanizado o fragmento de unión al antígeno.

5. Un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo para el uso según cualquier reivindicación precedente, en el que el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno comprende una cadena pesada que comprende la CDR1 de SEQ ID Nº:28, CDR2 de SEQ NO:30 y CDR3 de SEQ ID Nº:32, y una cadena ligera que comprende la CDR1 de SEQ ID Nº:13, CDR2 de SEQ ID Nº:15 y CDR3 de SEQ ID Nº:17.

6. Un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo para el uso según la reivindicación 5, en el que el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno comprende una cadena pesada que comprende un dominio variable de SEQ ID Nº: 34 y una cadena ligera que comprende un dominio variable de SEQ ID Nº: 19.

7. Un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo para el uso según la reivindicación 6, en el que el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº:22 ó 26 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº:

11.

8. Un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo para el uso según cualquier reivindicación precedente, en el que el anticuerpo es producido por células que tienen el nº de acceso de la ATCC PTA-7554 o el nº de acceso de la ATCC PTA-9017.

9. Un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo para el uso según cualquier reivindicación precedente, en el que dicha célula es una célula de mamífero.

10. Un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo para el uso según cualquier reivindicación precedente, en el que dicha célula es una célula neoplásica.

HMVEC sin cribar HMVEC cribadas

Microscopía óptica Anti-endosialina fluorescente

Endosialina se une a Colágeno I y M4 inhibe la unión Inhibición mediante M4 de la unión de Fc-TEM-1 a COL I

Endosialina incrementa la adhesión celular a colágeno Adhesión de CHOK1 y CHOTEM1 a una placa revestida con COL I

Expresión de integrina β1 total en células 293T y 293T/TEM1 +/- M4

Expresión de integrina β1 activa en células 293T y 293T/TEM1 +/-M4