Método para seleccionar agentes activos que estimulan la expresión de CERT para mejorar las funciones de barrera de la piel.

Un método para la selección de agentes activos, que son capaces de prevenir o combatir los signos cutáneos producto del deterioro no patológico de la función de barrera,

que comprende las siguientes etapas:

a) tratar una muestra de queratinocitos cultivados de un donante humano con un agente activo, tal como un extracto botánico;

b) cuantificar la expresión de CERT en dicha muestra tratada, con respecto a la misma muestra de células que no haya sido tratada;

c) seleccionar los agentes que proporcionan un incremento de la expresión de CERT con respecto a la muestra no tratada.

Método para seleccionar agentes activos que estimulan la expresión de CERT para mejorar las funciones de barrera de la piel

Sector de la técnica

La presente invención se refiere a un método para la selección de un agente activo destinado a prevenir o combatir los signos cutáneos producto del deterioro no patológico de la función de barrera, que comprende la selección de agentes activos que estimulan la expresión de la proteína de transporte de ceramida CERT en queratinocitos humanos cultivados.

Estado de la técnica

La piel está constituida principalmente por tres capas, en concreto, partiendo desde la capa más externa, la epidermis, la dermis y la hipodermis.

La epidermis, en particular, está constituida por queratinocitos (predominantemente), melanocitos (involucrados en la pigmentación de la piel) y células de Langerhans. Su función es proteger al cuerpo del ambiente externo y garantizar su integridad, y en particular detener la penetración de microorganismos o sustancias químicas, impedir la evaporación del agua contenida en la piel y constituir una barrera contra ataques externos y en particular contra los rayos ultravioletas (UV).

Para ello, los queratinocitos experimentan un proceso de proliferación y maduración dirigida continua durante la cual los queratinocitos localizados en la capa basal de la epidermis forman, en la fase final de su diferenciación, corneocitos, que son células muertas totalmente queratinizadas en forma de vainas córneas constituidas por proteínas y lípidos tales como ceramidas epidérmicas. Durante este proceso de diferenciación, también se forman lípidos epidérmicos intercorneocitarios y a continuación se organizan en forma de bicapas (lámelas) en el estrato córneo, y participan, con las vainas córneas anteriormente mencionadas, en la función de barrera de la epidermis.

El contenido de lípidos del estrato córneo consta aproximadamente del 5 % de ceramidas, el 25 % de colesterol, y el 15% de ácidos grasos libres. Los queratinocitos sintetizan las ceramidas epidérmicas en una cascada de reacciones complejas de varias etapas que comienza en el retículo endoplasmático (RE). Las ceramidas son transportadas desde el RE al aparato de Golgi para su posterior modificación en esfingomielina mediante el transporte vesicular o no vesicular. El transporte no vesicular es el mecanismo principal. A continuación la esfingomielina es transportada a los cuerpos lamelares y excretada de los queratinocitos para su procesamiento posterior en el estrato córneo, durante la diferenciación terminal, en algunas de las ceramidas epidérmicas que a continuación se incorporan a las estructuras de la membrana lamelar que favorecen la permeabilidad de la barrera para la pérdida de agua (Y. Uchida y col., Journal of Lipid Research, Vol. 41,271-282, 2).

No obstante, la función de barrera de la epidermis puede verse perturbada en ciertas condiciones climáticas (por ejemplo, bajo los efectos del frío y/o el viento) o bajo los efectos de tensión o fatiga en particular, promoviendo así la penetración de alérgenos, irritantes o microorganismos. Estos factores externos pueden dar lugar a sequedad de la piel (la piel pierde su permeabilidad, se deshidrata y su pérdida de agua transepidérmica se incrementa), y a sensaciones de calor o enrojecimiento, y también deterioran el brillo del cutis y la flexibilidad de la piel. El deterioro de la barrera cutánea también puede promover la aparición de microgrietas o microfisuras.

Además, una barrera mal formada, como resultado de procesos de proliferación y diferenciación alterados, deja de proteger la piel frente a la radiación UV o cualquier otro tipo de ataque externo. Los rayos UV que penetran en la piel entonces pueden producir radicales libres que pueden tener un efecto perjudicial sobre diversas dianas, tales como la activación de colagenasas y elastasas que son responsables de la degradación del colágeno y la elastina, respectivamente, y de este modo de la reducción en la elasticidad y firmeza de la piel y la formación de arrugas.

Para prevenir o corregir este fenómeno, la práctica conocida es aplicar composiciones cosméticas a la piel que contienen agentes higroscópicos, tales como azúcares o polioles, que están destinados a captar el agua presente en la piel y de esta forma impedir su evaporación. Habitualmente también se han usado sustancias grasas que permiten la formación de una película oclusiva sobre la piel, que contribuye a impedir la evaporación de agua. Además, estas composiciones con frecuencia incorporan agentes activos que actúan sobre una o más de las diversas dianas biológicas involucradas en los procesos de renovación de la piel, en particular en la diferenciación de queratinocitos, la síntesis de lípidos epidérmicos y la cohesión de corneocitos, o en la síntesis endógena de constituyentes del factor humectante natural (NMF), en particular en la síntesis de proteoglicanos.

Ejemplos de dichos agentes activos son, en particular, a- y (3-hidroxiácidos, especialmente, ácido láctico, ácido glicólico y ácido salicílico; urea; y compuestos aminosulfónicos.

También es práctica conocida la mejora de la función de barrera de la piel aplicando sobre la piel un intermedio de

las vías sintéticas, o un precursor, para ceramidas seleccionadas entre las bases esfinganina y esfingosina, tales como 6-hidroxil-4-esfingenina (documento FR 2.811.556).

De forma similar, también se ha propuesto actuar sobre algunas dianas biológicas que incrementan el contenido de ceramida de los lípidos de la piel, con el fin de mejorar la función de barrera de la piel. Entre estas dianas se pueden mencionar las p-glucosidasas, de las que se ha demostrado que son estimuladas por carbohidratos tales como O- octanoil-6'-maltosa (documento WO 2/3811). El documento WO 29/77995 enseña el uso de un agente que modula la expresión de ceramidasa ácida para prevenir o tratar los signos del envejecimiento de la piel, así como un método de selección de dichos agentes. El documento WO 28/151891 enseña un método de selección de agentes activos cosméticos que estimulan el nivel de expresión de FN3K, y el uso de dichos agentes para prevenir o combatir los signos cutáneos del deterioro de la función de barrera de la piel. No obstante, siempre existe la necesidad de proponer nuevos agentes activos cosméticos para reforzar la función de barrera de la piel con el fin de prevenir y/o reducir las sensaciones de molestia, escozor, tirantez, picor cutáneos, sensaciones de calor o enrojecimiento y/o la aparición de microgrietas o microfisuras y/o la pérdida de tersura del cutis, o cutis apagado y/o la pérdida de flexibilidad de la piel y/o para mejorar la protección de la epidermis frente a los rayos UV.

Además, dada la búsqueda incesante por los consumidores de productos naturales que contengan la menor cantidad posible de ingredientes sintéticos, y las restricciones normativas cada vez más rigurosas sobre compuestos derivados de la industria química, sería deseable que estos agentes activos cosméticos fuesen de origen vegetal.

Ahora, el Solicitante ha demostrado de forma inesperada que es posible actuar sobre una nueva diana biológica, en concreto el transportador de ceramida CERT, estimulando la expresión de esta proteína, con el fin de combatir el deterioro de la función de barrera. El Solicitante también ha desarrollado en su haber un ensayo de selección adecuado para seleccionar agentes activos tales como extractos vegetales que actúan sobre esta diana, posibilitando de esta forma satisfacer las necesidades anteriormente mencionadas.

La proteína transportadora de ceramida CERT descubierta recientemente ha dilucidado una nueva vía para la introducción de ceramidas sintetizadas en el RE hacia el Golgi para su transformación en esfingomielina (Flanada y col. Nature 426:83-89). La proteína es idéntica en secuencia, aunque no en la función propuesta, a la variante de procesamiento alternativo GPBPA26 de la proteína de unión al antígeno de Goodpasture (GPBP). La mutación de CERT da lugar a células con un contenido de esfingomielina significativamente reducido. En células de D. melanogaster, la mutación de CERT produjo cambios en la fluidez de la membrana celular que dieron lugar a mayores daños por estrés oxidativo y redujeron la esperanza de vida del organismo (Rao y col. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 14:11364-11369). La exposición de queratinocitos cultivados o piel de ratón ex vivo a UVB incapacitó al CERT para transportar eficazmente la ceramida y además produjo un incremento de la muerte celular (Charruyer y col. J. Biol. Chem. 283: 16682-16692).

Para mejorar el transporte de ceramida, en el documento EP 1.652.53 se ha propuesto... [Seguir leyendo]

1. Un método para la selección de agentes activos, que son capaces de prevenir o combatir los signos cutáneos producto del deterioro no patológico de la función de barrera, que comprende las siguientes etapas:

a) tratar una muestra de queratinocitos cultivados de un donante humano con un agente activo, tal como un extracto botánico;

b) cuantificar la expresión de CERT en dicha muestra tratada, con respecto a la misma muestra de células que no haya sido tratada;

c) seleccionar los agentes que proporcionan un incremento de la expresión de CERT con respecto a la muestra no tratada.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque la cuantificación de la expresión de CERT se realiza mediante RT-PCR.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 2, caracterizado porque la etapa c) comprende seleccionar los agentes activos que proporcionan un incremento de al menos 1,7 veces en el nivel de expresión génica de CERT, en comparación con una muestra sin tratar en la que la expresión es de 1.

4. El método de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque la cuantificación de la expresión de CERT se realiza mediante transferencia de Western.

5. El método de acuerdo con la reivindicación 4, caracterizado porque la etapa c) comprende seleccionar los agentes activos que proporcionan un nivel de proteína CERT que es al menos el 12% del expresado por la muestra sin tratar.

6. Uso del método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para seleccionar agentes activos capaces de prevenir o combatir los signos cutáneos resultantes del deterioro no patológico de la función de barrera cuando se aplican por vía tópica a piel humana.

7. Uso del método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para seleccionar agentes activos capaces de proteger la piel de los signos de sequedad, proteger la piel del ambiente externo, en particular de los efectos dañinos de los rayos UV o de la penetración de toxinas, fármacos, sustancias químicas, y reducir la carga oxidante de la piel, cuando se aplica por vía tópica a piel humana.

8. Uso de acuerdo con la reivindicación 7, caracterizado porque dichos signos se seleccionan entre: aspereza de la piel, pérdida de brillo del cutis y/o la pérdida de flexibilidad de la piel.

9. Uso del método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, para seleccionar agentes activos capaces de prevenir el fotoenvejecimiento de la piel cuando se aplican por vía tópica a piel humana.