Inhibidores de micro-ARN para uso para prevenir y/o atenuar el envejecimiento cutáneo.

Método in vitro para identificar sistemáticamente compuestos candidatos para prevenir y/o atenuar el envejecimiento de la piel,

que comprende las siguientes etapas:

a. poner al menos un compuesto de ensayo en contacto con una muestra de fibroblastos;

b. medir la expresión o la actividad de al menos un microARN elegido entre miR-134 y miR-152 en dichos fibroblastos;

c. seleccionar los compuestos para los que una inhibición de al menos un 20 %, preferentemente al menos un 30 %, preferentemente al menos un 40 % de la expresión o una inhibición de al menos un 20 %, preferentemente al menos un 30 %, preferentemente al menos un 40 % de la actividad de al menos un microARN se mide en los fibroblastos tratados en a. en comparación con los fibroblastos sin tratar.

Inhibidores de micro-ARN para uso para prevenir y/o atenuar el envejecimiento cutáneo Sector de la técnica

La divulgación se refiere a la identificación y el uso de compuestos que inhiben la expresión o la actividad de los microARN para prevenir y/o atenuación del envejecimiento cutáneo.

Estado de la técnica

La senescencia celular es una forma de parada irreversible del crecimiento, descrita originalmente para células en cultivo que se encuentran en la etapa final de la proliferación, pero que se sabe que se estimulan con distintos estímulos, tales como lesiones del ADN, estrés oxidativo, quimioterapia y exceso de estímulos mitóticos tales como la activación oncogénica (Serrano et al. 1997; Campisi 2001; Schmitt et al. 2002). Las células entran en una etapa de parada irreversible, mostrando rasgos distintivos, que incluyen aumento de la actividad de la beta-galactosidasa y aumento de la expresión de mediadores fundamentales incluyendo la proteína de la leucemia promielocítica, p53 (PML), p16INK4a y p19Arf (Serrano et al., 1997, Narita et al., 2003; Sharpless et al., 2004). Aunque se ha estudiado principalmente in vitro, la senescencia celular mantiene una relación correlativa con el proceso del envejecimiento a nivel de animal en su conjunto, lo que implica de este modo muchos de los factores que regulan la senescencia ya que contribuyen al envejecimiento del organismo (Sharpless y DePinho, 2004, Campisi, 2005).

Todas las células senescentes experimentan profundos cambios en la expresión genética. La formación de perfiles de expresión genética exhaustiva ha identificado genes en el ciclo celular, factor de crecimiento de insulina, interferón, MAP quinasa y rutas de estrés oxidativo como desreguladas de forma coherente durante la senescencia celular. La expresión del gen alterado da lugar al fenotipo senescente, y está bien establecida como parte de los mecanismos y las rutas que activan el programa de senescencia en las células. Sin embargo, los factores responsables de las alteraciones de la expresión genética durante la senescencia siguen siendo difíciles de alcanzar.

Los microARN (miARN) son moduladores fundamentales de la expresión genética en diversos procesos biológicos y patológicos. Los cambios en los niveles de expresión de miARN se producen en la senescencia celular y en el envejecimiento del organismo (Grillari et al. 2010; Hackl et al. 2010), y se han relacionado con cambios en los niveles de los mARN que son supuestas dianas de los miARN específicos (Lafferty et al. 2009; He et al. 2007; Maes et al. 2009). Vahos estudios han identificado conjuntos específicos de miARN regulados de forma positiva en senescencia replicativa de fibroblastos (Faraonio et al. 2012; Dhahbi et al. 2011; Yong Wang et al. 2010).

Por lo tanto, es deseable e importante proporcionar productos o agentes activos que eviten, reduzcan o incluso inhiban la senescencia celular, en particular la senescencia de fibroblastos.

Objeto de la invención

La presente divulgación proporciona de este modo un método para identificar tales agentes útiles.

La presente divulgación por lo tanto se refiere a un método in vitro para identificar sistemáticamente compuestos candidatos para prevenir y/o atenuar el envejecimiento de la piel, que comprende las siguientes etapas:

a. poner al menos un compuesto de ensayo en contacto con una muestra de fibroblastos;

b. medir la expresión o la actividad de al menos un microARN elegido entre miR-134 y miR-152 en dichos fibroblastos;

c. seleccionar los compuestos para los que una inhibición de al menos un 20 %, preferentemente al menos un 30 %, preferentemente al menos un 40 % de la expresión o una inhibición de al menos un 20 %, preferentemente al menos un 30 %, preferentemente al menos un 40 % de la actividad de al menos un microARN se mide en los fibroblastos tratados en a. en comparación con los fibroblastos sin tratar.

Preferentemente, los fibroblastos son fibroblastos presenescentes. Por lo tanto, la presente divulgación se refiere a un método in vitro para identificar sistemáticamente compuestos candidatos para prevenir y/o atenuar el envejecimiento de la piel, que comprende las siguientes etapas:

a. poner al menos un compuesto de ensayo en contacto con una muestra de fibroblastos presenescentes;

b. medir la expresión o la actividad de al menos un microARN elegido entre miR-134 y miR-152 en dichos fibroblastos presenescentes;

c. seleccionar los compuestos para los que una inhibición de al menos un 20 %, preferentemente al menos un 30 %, preferentemente al menos un 40 % de la expresión o una inhibición de al menos un 20 %, preferentemente al menos un 30 %, preferentemente al menos un 40 % de la actividad de al menos un microARN se mide en los fibroblastos presenescentes tratados en a. en comparación con los fibroblastos presenescentes sin tratar.

Por "fibroblastos presenescentes", se hace referencia a células que expresan p16 a un nivel detectable (este nivel se puede determinar por transferencia de Western). Estas células proliferan de forma más lenta que los fibroblastos jóvenes.

De acuerdo con una primera realización, la etapa b. se realiza antes y después de la etapa a. En este caso, la expresión o la actividad del microARN (elegido entre miR-134 y miR-152) medida en los fibroblastos, preferentemente presenescentes, antes de la etapa a. corresponde al valor de control (es decir fibroblastos sin tratar, preferentemente presenescentes). Por lo tanto, la etapa c. comprende la selección de los compuestos para los que una inhibición de al menos un 20 %, preferentemente al menos un 30 %, preferentemente al menos un 40 % de la expresión o una inhibición de al menos un 20 %, preferentemente al menos un 30 %, preferentemente al menos un 40 % de la actividad de al menos un microARN se mide en los fibroblastos, preferentemente presenescentes, tratados en a. en comparación con los mismos fibroblastos, preferentemente presenescentes, antes de la etapa a.

De acuerdo con otra realización, el método comprende una primera etapa a, de preparación de muestras de fibroblastos, preferentemente presenescentes. Por lo tanto, preferentemente, la presente invención se refiere a un método in vitro para identificar sistemáticamente compuestos candidatos para prevenir y/o atenuar el envejecimiento de la piel, que comprende las siguientes etapas:

a, preparar al menos dos muestras de fibroblastos, preferentemente presenescentes;

a. poner una de las muestras en contacto con al menos un compuesto de ensayo; a continuación

b. medir la expresión o la actividad de al menos un microARN elegido entre miR-134 y miR-152 en dichas muestras; y

c. seleccionar los compuestos para los que una inhibición de al menos un 20 %, preferentemente al menos un 30 %, preferentemente al menos un 40 % de la expresión o una inhibición de al menos un 20 %, preferentemente al menos un 30 %, preferentemente al menos un 40 % de la actividad de al menos un microARN se mide en los fibroblastos, preferentemente presenescentes, tratados en a. en comparación con la muestra de fibroblastos sin tratar, preferentemente presenescentes.

En esta segunda realización, la expresión o actividad del microARN elegido entre miR-134 y miR-152 medida en la muestra de fibroblastos, preferentemente presenescentes, y no sometida a la etapa a., corresponde al valor del control (es decir fibroblastos sin tratar, preferentemente presenescentes).

Mediante la expresión "envejecimiento de la piel" se hace referencia a cualquier cambio en el aspecto externo de la piel debido al envejecimiento, aunque éste sea cronobiológico y/o foto-inducido, tal como, por ejemplo, arrugas y líneas finas, piel debilitada, piel flácida, piel adelgazada, y piel carente de elasticidad y/o tono, y también cualquier cambio interno en la piel que no se refleja de forma sistemática mediante un aspecto externo cambiado, tal como, por ejemplo, cualquier degradación interna de la piel, en particular del colágeno, después de la exposición a la radiación ultravioleta.

Los miR de interés de acuerdo con la invención se eligen entre miR-134 y miR-152.

El miR-134 maduro tiene la SEC ID N21 (ugugacugguugaccagagggg). Es la secuencia HGNC:31519;

El miR-152 maduro tiene la SEC ID N2: 2 (UCAGUGCAUGACAGAACUUGG). Es la secuencia HGNC: 31538.

Estas secuencias provienen de la base de datos de HGNC.

La función de miR-134 se desconoce, aunque miR-152 se ha descrito como supresor tumoral en el cáncer de endometrio (Tsuruta et al. 2011) y en carcinomas hepatocelulares (Huang et al. 2010), en el último, tiene como objetivo la ADN metiltransferasa 1, causando metilación anómala del ADN. Sin quedar ligado por teoría... [Seguir leyendo]

1. Método in vitro para identificar sistemáticamente compuestos candidatos para prevenir y/o atenuar el envejecimiento de la piel, que comprende las siguientes etapas:

a. poner al menos un compuesto de ensayo en contacto con una muestra de fibroblastos;

b. medir la expresión o la actividad de al menos un microARN elegido entre miR-134 y miR-152 en dichos fibroblastos;

c. seleccionar los compuestos para los que una inhibición de al menos un 20 %, preferentemente al menos un 30 %, preferentemente al menos un 40 % de la expresión o una inhibición de al menos un 20 %, preferentemente al menos un 30 %, preferentemente al menos un 40 % de la actividad de al menos un microARN se mide en los fibroblastos tratados en a. en comparación con los fibroblastos sin tratar.

2. Método de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado por que la etapa b. se realiza antes y después de la etapa a.

3. Método de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado por que comprende las siguientes etapas:

a, preparar al menos dos muestras de fibroblastos;

a. poner una de las muestras en contacto con al menos un compuesto de ensayo; a continuación

b. medir la expresión o la actividad de al menos un microARN elegido entre miR-134 y miR-152 en dichas muestras; y

c. seleccionar los compuestos para los que una inhibición de al menos un 20 %, preferentemente al menos un 30 %, preferentemente al menos un 40 % de la expresión o una inhibición de al menos un 20 %, preferentemente al menos un 30 %, preferentemente al menos un 40 % de la actividad de al menos un microARN se mide en los fibroblastos tratados en a. en comparación con la muestra de fibroblastos sin tratar.

4. Método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por que dichos fibroblastos son fibroblastos presenescentes.

5. Método de acuerdo con la reivindicación 4, caracterizado por que los fibroblastos presenescentes se obtienen después de 70 duplicaciones de la población en condiciones de cultivo clásicas.

6. Método de acuerdo con la reivindicación 5, caracterizado por que las condiciones de cultivo clásicas comprenden un cultivo de los fibroblastos en medio 106 al que se añaden suplementos de crecimiento de LSGS, y se mantiene constantemente en un estado de subconfluencia.

7. Método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado por que los compuestos de ensayo se eligen entre extractos botánicos.

8. Método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado por que la inhibición de la expresión o de la actividad del microARN medido en la etapa c. es de al menos un 50 %, preferentemente de al menos un 60 %.