Método para la determinación de actividad glicosintasa y uso del mismo en el cribado de alta productividad de librerías de enzimas con actividad glicosintasa.

Método para la determinación de actividad glicosintasa y uso del mismo en el cribado de alta productividad de librerías de enzimas con actividad glicosintasa.

La presente invención se relaciona con un método de detección de actividad glicosintasa en una muestra que comprende: mezclar la muestra con un fluoruro de glicosilo y opcionalmente con un aceptor glicosídico, incubar, añadir un sililéter de fórmula (I), incubar, y medir la fluorescencia. Dicho método se puede utilizar en la selección de glicosintasas.

Método para la determinación de actividad glicosintasa y uso del mismo en el cribado de alta productividad de librerías de enzimas con actividad glicosintasa 5

Campo de la invención La presente invención se relaciona con un método de detección de actividad gliconsintasa en una muestra y su aplicación en la selección de glicosintasas.

Antecedentes de la invención Los carbohidratos son compuestos relevantes en el sector alimentario y biomédico. Su síntesis es compleja debido a la dificultad en el control regio y estereoquímico de los enlaces formados entre un dador y un aceptor

glicosídico o por auto-condensación de un dador glicosídico. La síntesis enzimática representa una alternativa atractiva a la síntesis química de dichos compuestos, ya que las enzimas pueden formar enlaces glicosídicos específicos en condiciones suaves y sin necesidad de utilizar estrategias de protección/desprotección de otros grupos funcionales. En la naturaleza, la catálisis de dicha síntesis enzimática la realizan las glicosil transferasas. Sin embargo, dichas enzimas ´tienen un uso limitado en la síntesis in vitro debido a, por una parte, la disponibilidad por problemas de expresión y solubilidad así como el elevado coste de los sustratos utilizados. Las glicosidasas, enzimas cuya función natural es la hidrólisis de enlaces glicosídicos, pueden actuar en el sentido sintético en condiciones adecuadas y han sido ampliamente utilizadas en la síntesis enzimática de carbohidratos. Sin embargo, la función hidrolítica sobre el enlace glicosídico formado conlleva una disminución del rendimiento de obtención de oligosacáridos y glicoconjugados mediante glicosidasas.

Las glicosidasas se mutaron en el centro activo para eliminar la actividad hidrolítica y catalizar así eficientemente la formación de enlaces glicosídicos, dando lugar a las enzimas conocidas como glicosintasas. Desde su introducción en 1998 [Withers S.G. et al., J. Am. Chem. Soc. 1998, 120, 5583-5584; y Planas A. et al., FEBS Lett. 1998, 440, 208-212], dichas enzimas han mostrado ser una herramienta eficiente para la síntesis de oligosacáridos y glicoconjugados. Su potencial sintético radica en la regio y estereoespecificidad enzimática y elevados rendimientos, permitiendo la síntesis de estructuras complejas en pocas etapas. Además, permiten el uso de sustratos no naturales.

Las glicosintasas se han optimizado por técnicas de evolución dirigida, ciclos adaptativos de generación de poblaciones variables y selección de las variantes más aptas. La etapa limitante en este proceso es la capacidad de seleccionar las variantes más aptas o mejoradas. Para ello, se han desarrollado sistemas de cribado de alta productividad (high throughput screening, HTS) capaces de analizar librerías de miles de muestras. En el estado de la técnica se han desarrollado varios métodos de selección de glicosintasas.

La mayor parte de estos métodos se basan en el análisis del producto generado a partir de un dador y aceptor glicosídicos por acción de una glicosintasa que presenta el nuevo enlace glicosídico.

Esta estrategia es la utilizada por Mayer et al. [Mayer C. et al., Chem. Biol. 2001, 8, 437-443], en donde se utiliza un sustrato fluorogénico como aceptor glicosídico que es condensado con un dador glicosídico por acción de la 45 glicosintasa, dando lugar a un producto que a su vez es el sustrato de una segunda enzima, cuya acción libera el fluoróforo del producto de condensación (sin hidrolizar el sustrato fluorogénico inicial) . Concretamente, Mayer et al. ensayaron la actividad de la Abg glicosintasa utilizando como enzima secundarias endo-celulasa Cel5A de Cellulomonas fimi, que escinde el celobiósido y celotriósido de 4-metilumbeliferilo liberando el alcohol metilumbeliferílico fluorescente. Sin embargo, dicho ensayo requiere un sustrato fluorogénico específico que se tiene que sintetizar expresamente para dicho ensayo y una enzima secundaria adecuada. Además, este tipo de ensayo solamente funciona con una combinación específica de enzima/sustrato y por lo tanto hay que poner a punto el método para cada tipo de glicosintasa a ensayar.

Lin et al. [Lin H. et al., J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 15051-15059] utilizan otra estrategia para el análisis del

producto de la reacción gicosintasa que se basa en la activación de un sistema reportador de dos componentes que únicamente se activa por proximidad espacial. Los autores describen la detección de actividad glicosintasa ligada a la transcripción del gen reportador leu2, en donde el crecimiento celular es dependiente de la actividad glicosintasa en ausencia de leucina. Sin embargo, esta aproximación necesita sustratos cuya síntesis es generalmente complicada. Además, como en el método anterior, hay desarrollar el método particular para cada tipo de glicosintasa a ensayar.

Hancock et al. [HancockS.M. et al., Anal. Biochem.2008, 382, 48-54; Hancock S.M. et al., Nature Chem. Biol. 2009, 5, 508-514] utilizan otra estrategia en la que utilizan anticuerpos que reconocen específicamente el producto de glicosidación y que permite realizar un inmunoensayo ELISA con reportador fluorescente. 65 Concretamente realizan el ensayo basándose en la especificidad de unión de un gangliósido, formado por la actividad de la glicosintasa (glicosintasa endoglicoceramidasa II, EGC) , a la subunidad B de toxina de cólera (CTB) . Sin embargo, este método requiere el uso de anticuerpos específicos para cada producto de glicosidación.

Aunque los métodos anteriores han mostrado una gran capacidad de cribado, su aplicabilidad fuera de la actividad específica para la que han sido diseñados es muy limitada.

Otra estrategia más general se basa en el ácido fluorhídrico generado como subproducto en la reacción glicosintasa.

Ben-David et al. [Ben-David A. et al., Chem. Biol. 2008, 15, 546-551] describen un método de detección de ácido liberado como subproducto de la reacción catalizada por la glicosintasa, mediante tinción con un indicador de pH tal como el rojo de metilo. Sin embargo, esta técnica depende de un tamponamiento muy suave del medio de reacción, lo que resta reproducibilidad al método por variabilidad de efecto matriz cuando se enfrenta a muestras de orígenes diferentes, es decir, pH diferentes.

Es conocido en el estado de la técnica la caracterización enzimática de glicosintasas aisladas mediante la cuantificación del ión fluoruro liberado en la reacción glicosintasa mediante el uso de electrodos selectivos de dicho ión fluoruro [e.g.. M. Faijes et. al., Biochemistr y 2003, 42, 13304-13318]. Sin embargo este sistema es difícilmente implementable para la medida simultánea de muchas muestras como es el caso de librerías de mutantes generados por técnicas de evolución dirigida.

También se conocen sensores químicos específicos para la detección de fluoruros [Kim S.Y. et al., Chem. Commun. 2009, 4735-4737; Yang X.F. et al., J. Fluoresc. 2007, 17, 81-87; Kim S.Y. et al., Org. Lett. 2007, 9, 3109-3112; y Yang X.F., Spectrochim. Acta A 2007, 67, 321-326]. Sin embargo, dichos sensores únicamente se han utilizado en muestras tales como muestras de agua y dentífricos, y no se han utilizado en el análisis de muestras de extractos celulares.

Sorprendentemente, los inventores han descubierto un método general de detección de actividad glicosintasa implementable en cribados de alta productividad que se puede utilizar en muestras biológicas basado en sensores químicos, concretamente silil éteres que comprenden un fluoróforo. El concepto es acoplar la producción de ión fluoruro como consecuencia de la actividad glicosintasa en extractos celulares expresando una glicosintasa activa con un sensor químico de ión fluoruro que genera una señal fluorescente. El método es implementable en formato de microplacas para el análisis simultáneo de un gran número de muestras como es el caso de cribados de alta productividad (HTS, high throughput screening) en programas de evolución dirigida de glicosintasas. El método es independiente de la glicosintasa particular, siendo el método universal para cualquier glicosintasa puesto que se basa en la detección de ión fluoruro liberado, subproducto de cualquier reacción glicosintasa.

Sumario de la invención En un primer aspecto, la invención se relaciona con un método de detección de actividad glicosintasa en una muestra que comprende:

(a) mezclar la muestra con un fluoruro de glicosilo y opcionalmente con un aceptor glicosídico;

(b) incubar;

(c) añadir un sililéter de fórmula (I)

(I)

en donde R1, R2 y R3 se seleccionan independientemente de alquilo C1-C8 y arilo C6-C14; R4 es =O y R5 es H, o R4 y R5 junto con...

1. Método de detección de actividad glicosintasa en una muestra que comprende:

(a) mezclar la muestra con un fluoruro de glicosilo y opcionalmente con un aceptor glicosídico;

(b) incubar;

(c) añadir un silil éter de fórmula (I)

(I)

en donde R1, R2 y R3 se seleccionan independientemente de alquilo C1-C8 y arilo C6-C14; R4 es =O y R5 es H, o R4 y R5 junto con los dos átomos de carbono a los que están respectivamente enlazados forman un grupo X se selecciona de entre N y CR6; R6 se selecciona de entre H, -CH2-COOMe, -CH2-COOH, alquilo C1-C8 y arilo C6-C14; y A representa un enlace sencillo o un grupo -fenilo-CH2-O-; y opcionalmente un disolvente orgánico polar;

(d) incubar, y

(e) medir la fluorescencia.

2. Método según la reivindicación 1, en donde R4 es =O y R5 es H.

3. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde X es CR6.

4. Método según la reivindicación 3, en donde R6 se selecciona del grupo que consiste en metilo, etilo, npropilo, iso-propilo, n-butilo, sec-butilo y terc-butilo.

5. Método según la reivindicación 4, en donde R6 es metilo.

6. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde A representa enlace sencillo.

7. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en donde R1, R2 y R3 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en metilo, etilo, n-propilo, iso-propilo, n-butilo, sec-butilo, tercbutilo y fenilo.

8. Método según la reivindicación 7, en donde R1, R2 y R3 se seleccionan independientemente de entre metilo y terc-butilo.

9. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en donde el silil éter es 4-metilumbeliferil-tercbutildimetilsililéter (MUTBS) de fórmula (II)

(II) .

10. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el fluoruro de glicosilo se selecciona del grupo que consiste en fluoruro de α-D-galactopiranosilo, fluoruro de α-D-glucopiranosilo, fluoruro de αxilosilo, fluoruro de 4-β-D-glucopiranosil-α-laminaribiosilo, fluoruro de lactosilo y fluoruro de α-Dxilopiranosilo.

11. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde en la etapa (c) se añade el disolvente 5 orgánico polar.

12. Método según la reivindicación 11, en donde el disolvente orgánico polarse selecciona del grupo que consiste en N, N-dimetilformamida (DMF) , dimetilsulfóxido (DMSO) y mezcla de los mismos.

13. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde entre las etapas (d) y (e) se ajusta el pH por encima de 7.

14. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la muestra es una muestra biológica.

15. Método según la reivindicación 14, en donde la muestra biológica es un lisado celular.

16. Método de selección de glicosintasas que comprende las etapas de:

(a) proveer una o más muestras con posible actividad glicosintasa,

(b) determinar la actividad glicosintasa en cada una de las muestras provistas en la etapa (a) mediante el 20 método definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, y

(c) seleccionar aquellas muestras que hayan dado positivo de actividad glicosintasa en la etapa (b) .

17. Método según la reivindicación 16, en donde la etapa (b) se realiza simultáneamente en al menos 4 muestras.

3456 7 89101112

A B

D 84 clones/placa E F

G H

μM 25 μM 50 μM 100 μM 200 μM 300 μM 400 μM

GlcαF pET16b Ctrl (Ctrl -)

p16-Bbl (Ctrl wt)

! [F-]

FIG. 1

2, 5 2, 0 1, 5 1, 0 0, 5

R factor = (F-F0) /F0

0, 0 -0, 5 -1, 0

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