Método para la detección de AMPc y GMPc.

Método in vitro para detectar el monofosfato cíclico de adenosina (AMPc) o el monofosfato cíclico de guanosina(GMPc),

que comprende

a) poner en contacto una mezcla que comprende AMPc o GMPc con un complejo de un indicador y unreactivador, donde el indicador es un fluoróforo unido covalentemente a un desactivador de AMPc, eldesactivador de AMPc es 2-(6-aminohexil)amino-AMPc, 8-(6-aminohexil)amino-AMPc, 8-(8-amino-3,6-dioxaoctilamino)-AMPc, 8-hidroxi-AMPc u 8-(4-mercaptobutiltio)-AMPc, y el desactivador de AMPc es capaz dedesactivar el fluoróforo al que está unido covalentemente, y el reactivador es capaz de unirse al desactivador deAMPc así como al nucleótido cíclico a detectar, y

b) medir el cambio de fluorescencia, donde el cambio de fluorescencia medido se compara con un control.

Método para la detección de AMPc y GMPc

Los nucleótidos desempeñan una función importante en la transducción de señales de una célula. Por ejemplo, el nucleótido AMPc está implicado en la transducción de señales de los receptores acoplados a proteínas G (GPCR) .

Los GPCR forman la clase más abundante de dianas farmacéuticas de fármacos. Para ensayar la actividad de posibles nuevas medicinas sobre los GPCR en el descubrimiento de fármacos, se requieren ensayos que inspeccionen la función de los receptores en su medio celular. Para el cribado de alto rendimiento, una de las primeras etapas del proceso de descubrimiento de fármacos, es necesario que estos ensayos funcionales sean sencillos y tengan pocas etapas, sean sensibles para detectar pequeños efectos de los compuestos en sus primeras fases de desarrollo e incluyan una lectura fiable que pueda aplicarse de manera automatizada.

Los ensayos funcionales para los GPCR pueden establecerse mediante la detección de moléculas de segundos mensajeros que reflejen el estado de activación del receptor. Dicha molécula de segundo mensajero es el monofosfato cíclico de adenosina (AMPc) formado tras la modulación de la actividad de la adenilil ciclasa. W. Thomsen et al. (Current Opinion in Biotechnology 2005, 16, 655-665) proporcionan una visión general de kits de ensayo funcionales disponibles en el mercado que determinan el nivel de AMPc celular basándose en la lectura de fluorescencia o quimioluminiscencia.

Kraemer et al. investigan en Journal of Molecular Biology 2001, 306, 1167-1177 el equilibrio y la cinética de la interacción del AMPc y Epac1 utilizando análogos de AMPc fluorescentes y diferentes construcciones de dominios de Epac1.

Gabriel et al. desvelan en Assay and Drug Development Technologies, 2003, 1, 291-303 bioensayos basados en fluorescencia para la detección de la actividad de receptores y efectos de ligandos en células que expresan los receptores de las rutas de transducción de señales respectivas mediante la determinación del AMPc en células con o sin tratamiento con ligando usando lisis.

Williams, C. revisa en Nature Review, Drug Discover y , 2004, 3, 125-135 métodos de detección de AMPc.

La presente invención proporciona un ensayo sencillo para detectar AMPc y su uso para detectar indirectamente la actividad de receptores y para seleccionar ligandos.

Esta invención se basa en el hecho sorprendente de que ciertos conjugados con derivados de AMPc, diseñados por modificación de la nucleobase, pueden desactivar la emisión de fluorescencia de un fluoróforo mientras que el AMPc no desactiva el fluoróforo.

Por lo tanto, la presente invención proporciona un método in vitro para detectar monofosfato cíclico de adenosina (AMPc) o monofosfato cíclico de guanosina (GMPc) que comprende a) poner en contacto una mezcla que comprende AMPc o GMPc con un complejo de un indicador y un reactivador, donde el indicador es un fluoróforo unido covalentemente a un desactivador de AMPc, el desactivador de AMPc es 2- (6-aminohexil) amino-AMPc, 8- (6aminohexil) amino-AMPc, 8- (8-amino-3, 6-dioxaoctilamino) -AMPc, 8-hidroxi-AMPc u 8- (4-mercaptobutiltio) -AMPc, y el

desactivador de AMPc puede desactivar el fluoróforo al que está unido covalentemente, y el reactivador puede unirse al desactivador de AMPc así como al nucleótido cíclico a detectar, y b) medir el cambio de fluorescencia, donde el cambio de fluorescencia medido se compara con un control.

Sorprendentemente, el ensayo también puede usarse para detectar GMPc en una mezcla. A diferencia del AMPc, el GMPc tiene capacidades desactivadoras, pero solo a una concentración de aproximadamente 1 mM y superiores. Sin embargo, las concentraciones celulares de GMPc están normalmente en el intervalo de varios órdenes de magnitud por debajo de 1 mM.

Por lo tanto, la presente invención proporciona un método in vitro para detectar AMPc o GMPc.

El cambio de la fluorescencia medido se compara con un control. El control puede ser una curva patrón con una cantidad de nucleótido predeterminada.

El término “mezcla” se refiere a dos o más sustancias mezcladas entre sí de tal manera que cada una de ellas permanece inalterada. La mezcla incluye, pero no se limita a, lisados celulares, sobrenadantes de cultivo celular, líquidos biológicos, tales como, suero, plasma, orina, líquido de lavado bronquial, esputo, o biopsias tales como líquido cefalorraquídeo.

El término “nucleótido” se refiere a una molécula que comprende una nucleobase, un azúcar y uno (MP) , dos (DP) o 65 tres (TP) grupos fosfato. Existen cinco nucleobases: Adenina (A) , Uracilo (U) , Timina (T) , Guanina (G) y Citosina (C) . El azúcar es una ribosa o una desoxirribosa (d) .

La expresión “nucleótido cíclico” se refiere a un nucleótido en el que el grupo fosfato está unido a dos de los grupos hidroxilo del azúcar, formando una estructura cíclica o de anillo. Estos incluyen AMP cíclico (AMPc) , CMP cíclico (CMPc) , TMP cíclico (TMPc) , UMP cíclico (UMPc) y GMP cíclico (GMPc) .

La expresión “desactivador de AMPc”, como se usa en el presente documento, se refiere a un derivado de AMPc que puede desactivar el fluoróforo usado en el ensayo. El desactivador se une covalentemente a dicho fluoróforo. El desactivador de AMPc es un derivado de AMPc en el que la nucleobase se ha sustituido por un donador de electrones. Como se muestra en la Figura 11B, la posición de la nucleobase para la sustitución es la posición 2 u 8. Son derivados de AMPc 2- (6-aminohexil) amino-AMPc (2-AHA-AMPc) , 8- (6-aminohexil) amino-AMPc (8-AHA-AMPc) ,

8- (8-amino-3, 6-dioxaoctilamino) -AMPc (8-ADOA-AMPc) , 8-hidroxi-AMPc (8-OH-AMPc) y 8- (4-mercaptobutiltio) -AMPc (8-MBT-AMPc) . El derivado más preferido es 2-AHA-AMPc.

El término “fluoróforo” se refiere a una molécula que emite fluorescencia cuando se excita con una longitud de onda específica y que puede desactivarse de forma estática. Un fluoróforo preferido es un derivado de oxazina como se describe en el documento EP 747 447 tal como, por ejemplo, MR121, Evoblue30 o JA314. Otros fluoróforos preferidos que pueden usarse son ATTO' 590, ATTO™ 655, ATTO' 680, Atto' 700 (Atto-Tec GmbH, Am Eichenhang 50, 57076 Siegen, Alemania) . Más preferentemente, el fluoróforo es MR121 o Atto' 700.

El término “reactivador”, como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula que invierte el efecto de desactivación del desactivador de AMPc al unirse al desactivador de AMPc. Es esencial que el reactivador sea capaz de unirse al desactivador de AMPc así como al nucleótido cíclico que va a detectarse, es decir, AMPc o GMPc.

El reactivador puede ser una proteína de unión. Preferentemente, el reactivador es un anticuerpo específico contra AMPc. El anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal o policlonal. Si el reactivador es una proteína, el valor de pH tiene que estar adaptado a un intervalo en el que la proteína sea capaz de unirse. Normalmente, este intervalo de pH es de 6, 8 a 7, 8.

Los expertos en la técnica conocen bien métodos para producir anticuerpos que son específicos para un nucleótido.

Kohler y Milstein (Nature 1975, 256: 495-497) , por ejemplo, describen métodos para producir anticuerpos monoclonales.

El complejo de detección comprende un indicador y un reactivador. El indicador consiste en un fluoróforo unido covalentemente a un desactivador de AMPc. El complejo de detección muestra fluorescencia si se excita. Cuando el

complejo de detección entra en contacto con un nucleótido, el reactivador se une a un determinado porcentaje del nucleótido libre y abandona el complejo de detección. El indicador ahora ya no se reactiva más y cuando se excita no muestra fluorescencia o solo muestra una fluorescencia baja. Esta disminución de la fluorescencia es indicativa de la cantidad de nucleótido presente en el sistema.

El cambio de fluorescencia puede compararse con un control, tal como una curva patrón. Una curva patrón puede establecerse midiendo el cambio de fluorescencia para cantidades predeterminadas del nucleótido a detectar.

La presente invención también proporciona el uso de los métodos descritos anteriormente para determinar la concentración de AMPc en una mezcla. Adicionalmente, el método descrito anteriormente puede usarse para 45 determinar la actividad de receptores cuando la transducción de señales de estos receptores comprende AMPc o GMPc. Preferentemente, el receptor es un receptor acoplado a proteínas G (GPCR) .

Por lo tanto, la presente invención también proporciona un método in vitro para... [Seguir leyendo]

1. Método in vitro para detectar el monofosfato cíclico de adenosina (AMPc) o el monofosfato cíclico de guanosina (GMPc) , que comprende a) poner en contacto una mezcla que comprende AMPc o GMPc con un complejo de un indicador y un reactivador, donde el indicador es un fluoróforo unido covalentemente a un desactivador de AMPc, el desactivador de AMPc es 2- (6-aminohexil) amino-AMPc, 8- (6-aminohexil) amino-AMPc, 8- (8-amino-3, 6dioxaoctilamino) -AMPc, 8-hidroxi-AMPc u 8- (4-mercaptobutiltio) -AMPc, y el desactivador de AMPc es capaz de desactivar el fluoróforo al que está unido covalentemente, y el reactivador es capaz de unirse al desactivador de AMPc así como al nucleótido cíclico a detectar, y b) medir el cambio de fluorescencia, donde el cambio de fluorescencia medido se compara con un control.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la mezcla es un lisado celular. 15

3. Un método in vitro para determinar la actividad de un receptor, en el que la transducción de señales del receptor comprende AMPc o GMPc, que comprende a) poner en contacto células que expresan dicho receptor con un complejo de un indicador y un reactivador,

donde el indicador es un fluoróforo unido covalentemente a un desactivador de AMPc, el desactivador de AMPc es 2- (6-aminohexil) amino-AMPc, 8- (6-aminohexil) amino-AMPc, 8- (8-amino-3, 6-dioxaoctilamino) -AMPc, 8-hidroxi-AMPc u 8- (4-mercaptobutiltio) -AMPc y el desactivador de AMPc es capaz de desactivar el fluoróforo al que está unido covalentemente, y el reactivador es capaz de unirse al desactivador de AMPc así como al nucleótido cíclico a detectar,

b) lisar las células, y c) medir el cambio de fluorescencia, donde el cambio de fluorescencia medido se compara con un control.

4. El método de acuerdo con la reivindicación 3, en el que la etapa b) es anterior a la etapa a) .

5. Un método in vitro para seleccionar un ligando para un receptor, en el que la transducción de señales del receptor comprende AMPc o GMPc, que comprende

a) poner en contacto un compuesto candidato con una célula que expresa dicho receptor, b) añadir a las células un complejo de un indicador y un reactivador, donde el indicador es un fluoróforo unido

covalentemente a un desactivador de AMPc, el desactivador de AMPc es 2- (6-aminohexil) amino-AMPc, 8- (6aminohexil) amino-AMPc, 8- (8-amino-3, 6-dioxaoctilamino) -AMPc, 8-hidroxi-AMPc u 8- (4-mercaptobutiltio) -AMPc y el desactivador de AMPc es capaz de desactivar el fluoróforo al que está unido covalentemente, y el reactivador es capaz de unirse al desactivador de AMPc así como al nucleótido cíclico a detectar, c) efectuar la lisis de las células, y

d) medir el cambio de fluorescencia, donde el cambio de fluorescencia medido se compara con un control.

6. El método de acuerdo con la reivindicación 5, en el que la etapa c) es anterior a la etapa b) .

7. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6, en el que el receptor es un receptor 45 acoplado a proteínas G.

8. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el desactivador de AMPc es 2 (6-aminohexil) amino-AMPc.

9. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el fluróforo es 1-[3- (2, 5-dioxopirrolidin-1-iloxicarbonil) -propil]-11-etil-3, 4, 8, 9, 10, 11-hexahidro-2H-13-oxa-6, 11-diaza-1-azonia-pentaceno (MR121) .

10. El uso del método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 8 y 9 para determinar la concentración de AMPc o de GMPc en una mezcla. 55

11. Un kit que comprende un indicador y un reactivador, en el que el indicador es un fluoróforo unido covalentemente a un desactivador de AMPc, el desactivador de AMPc es 2- (6-aminohexil) amino-AMPc, 8- (6-aminohexil) amino-AMPc, 8- (8-amino-3, 6-dioxaoctilamino) -AMPc, 8-hidroxi-AMPc u 8- (4-mercaptobutiltio) -AMPc, y el desactivador de AMPc es capaz de desactivar el fluoróforo al que está unido covalentemente, y el reactivador es capaz de unirse al

desactivador de AMPc así como al nucleótido cíclico a detectar.