Método para amplificar la vía de las pentosas fosfato en cepas de levaduras, levaduras obtenidas y sus aplicaciones.

Método de obtención de cepas mutantes de levaduras que tienen una VPP (vía de las pentosas fosfato) amplificada,

caracterizada por que comprende las etapas

- de cultivo de las cepas sobre un sustrato a base de una sal de ácido glucónico,

- de adaptación durante al menos 10 generaciones, a una temperatura de incubación de 16ºC a 32ºC,

preferentemente de 28ºC, bajo agitación,

- de selección de las cepas adaptadas que han acumulado unas mutaciones que permiten una amplificación de la VPP, por ensayo de crecimiento, sobre los cultivos que tienen una DO superior a al menos 1,3 veces la de la cepa parental.

Método para amplificar la vía de las pentosas fosfato en cepas de levaduras, levaduras obtenidas y sus aplicaciones La invención tiene por objeto un método para aumentar el flujo a través de la vía de las pentosas fosfato (VPP) y las levaduras así obtenidas. Se refiere asimismo a las aplicaciones de estas levaduras, en particular en las industrias de fermentación.

Estando la VPP en el centro del metabolismo carbonado y redox de la levadura, una amplificación de esta vía presenta un interés para conducir a una remodelación metabólica significativa y así conferir nuevas propiedades a la levadura.

La obtención de una cepa de levadura que tiene una VPP amplificada se puede prever a través de diferentes estrategias.

Estos los últimos años se han desarrollado numerosos enfoques con el objetivo de obtener unas cepas de Scerevisiae capaces de fermentar las pentosas. Así, se han obtenido unas cepas de S. cerevisiae capaces de fermentar la xilosa en etanol mediante expresión de los genes heterólogos que permiten su asimilación (Eliasson et al., 2000) . Sin embargo, la formación de etanol por estas cepas sigue siendo limitada debido a la secreción de una parte de la xilosa consumida en forma de xilitol. La acumulación de xilitol podría proceder de la limitación del flujo a través de la parte no oxidativa de la VPP en S. cerevisiae. En efecto, los estudios sobre los mutantes que poseen una mejor capacidad para metabolizar la xilosa han mostrado un aumento de la actividad de su transaldolasa o su transcetolasa, o bien las dos (Becker et al., 2003; Sonderegger et al., 2005; Pitkanen et al., 2005) . Además, la deleción de uno de los dos genes (ZWF1, GND1) que codifican las enzimas NADPH dependientes del segmento oxidativo permite disminuir también el rendimiento de la producción de xilitol y aumentar el rendimiento de etanol (Eliasson et al., 2000; Jeppsson et al., 2002) .

La selección de mutantes por evolución dirigida constituye una alternativa a los enfoques de ingeniería metabólica. Este enfoque se basa en la selección de variantes, obtenidas por mantenimiento de una cepa durante numerosas generaciones en condiciones selectivas para forzar la adaptación. Este principio de selección fue elegido por los inventores que, de manera sorprendente, han conseguido seleccionar unas variantes que tienen acumuladas unas mutaciones que permiten una amplificación significativa de la VPP. Estas mutaciones permiten degradar más gluconato y confieren a las cepas unas propiedades nuevas, totalmente inesperadas (reducción de la producción de acetato, aumento de la de los ésteres, necesidades en nitrógeno reducidas) .

Por lo tanto, la invención tiene como objetivo proporcionar un método de obtención de mutantes de levaduras en los que la VPP está amplificada con respecto a una cepa parental.

Pretende también proporcionar unos mutantes de levadura cuyo metabolismo, de manera inesperada, se ha remodelado con respecto a las cepas parentales, tras la amplificación de la vía VPP.

La invención pretende además aprovechar las propiedades de estas levaduras, en particular en las industrias de fermentación.

El método de obtención de cepas mutantes de levaduras según la invención se caracteriza por que comprende el cultivo de las cepas sobre un sustrato a base de un derivado glucónico, más particularmente de una sal de ácido glucónico (siendo tal sal designada en lo sucesivo de manera abreviada por el término "gluconato") .

De manera ventajosa, el gluconato se incorpora en la VPP a nivel de la 3ª etapa.

El cultivo de las cepas se efectúa a fin de permitir su adaptación en condiciones de cultivo desfavorables, durante al menos 10 generaciones, a una temperatura de incubación de 16º C a 32º C, preferentemente de 28º C, bajo agitación.

Los mutantes que han acumulado unas mutaciones que permiten una amplificación de la VPP son ventajosamente seleccionados mediante un ensayo de crecimiento y se recuperan los que tienen una densidad óptica (DO) superior a al menos 1, 3 veces la de la cepa parental.

La invención se refiere también a los mutantes de cepas de levadura que tienen una VPP mejorada con respecto a una cepa parental.

Estos mutantes se caracterizan por que son susceptibles de ser obtenidos por un procedimiento de cultivo que comprende las etapas:

- de adaptación de una cepa de levadura, durante al menos 10 generaciones, utilizando como única fuente de carbono un sustrato a base de gluconato,

- de selección de los mutantes que han acumulado unas mutaciones que permiten una amplificación de la VPP, que tienen una DO final de al menos 1, 3 veces superior a la de la cepa parental no sometida a las condiciones de adaptación anteriores.

Más especialmente, la invención se refiere a los mutantes de cepas de levadura que tienen, con respecto a una cepa parental, una VPP mejorada, una velocidad de fermentación superior y, por lo tanto, un consumo más rápido de glucosa, así como una reducción de la producción de acetato.

De manera ventajosa, los mutantes de la invención se caracterizan por una fuerte producción de compuestos aromáticos, tal como el alcohol isoamílico, el acetato de isoamilo, el 2-feniletanol. Las cepas de levadura pertenecen preferentemente al género Saccharomyces, en particular a las especies cerevisiae, Bayanus o a los géneros no Saccharomyces.

Las cepas preferidas pertenecen al genero Saccharomyces y comprenden, en particular, las especies Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces bayanus, Saccharomyces uvarum y Saccharomyces kudriavzevii. Otras cepas preferidas pertenecen al género no Saccharomyces.

La invención se refiere también a los híbridos de las cepas definidas anteriormente. La invención está dirigida en particular a la cepa adaptada de Saccharomyces cerevisiae depositada en la Colección Nacional de Cultivo de Microorganismos (CNCM) , 25 rue du Dr Roux, Paris, con fines de depósito según el tratado de Budapest, bajo el nº CNCM I-4216, el 29 de julio de 2009.

La amplificación de la VPP en las cepas mutantes de la invención permite, en particular: -una disminución de la producción de etanol -una disminución de la producción de acetato -una modificación de la producción de ciertos compuestos de aromas -un aumento de la velocidad de fermentación. Estas propiedades presentan un gran interés para diferentes utilizaciones de la levadura, en particular en las industrias de fermentación.

Otras características y ventajas de la invención son dadas en los ejemplos siguientes, en los que se hace referencia a las figuras 1 a 5, que representan, respectivamente, -las figuras 1 y 2: los resultados de ensayos de crecimiento de una cepa procedente de una adaptación sobre gluconato (I-4216) y de la cepa parenteral (I-4215) , sobre medio YNB glucosa (2%) (figura 1) y sobre medio YNB gluconato (2%) (figura 2) ; -la figura 3, la velocidad de fermentación de estas cepas; -la figura 4, la distribución de los flujos metabólicos en una cepa de la invención y en una cepa parenteral, y -la figura 5, los histogramas que representan el gluconato residual en el medio.

Adaptación dirigida y modo de cultivo La cepa industrial I-4215 se ha cultivado en unos tubos de 13 ml que contienen 5 ml de medio YNB gluconato [Yeast nitrogen base al 0, 67% DIFCO, y gluconato al 2% (Sigma) ]. Se realizaron dos cultivos en paralelo. Los cultivos se siembran a una densidad óptica (DO) de 0, 1, a partir de un precultivo de una noche sobre YEPD (Bacto Yeast Extract al 1% (Difco) , Bacto Peptona el 2% (Difco) , glucosa al 2%) . Con el objetivo de eliminar cualquier traza de glucosa, las células son centrifugadas y lavadas con agua estéril. El cultivo se realiza durante numerosas generaciones, diluyendo las células por transferencia en un nuevo medio cada 3 generaciones (DO=0, 8) . Los cultivos son incubados a 28º C bajo agitación (250 rpm) . Al ser el crecimiento sobre este sustrato es muy lento, se necesitan 8 días para alcanzar una DO de 0, 8.

Análisis de las cepas adaptadas

A intervalos regulares, se extienden 200 ï?­l de cultivos sobre una caja que contiene un medio YEPD, a fin de realizar unos ensayos de crecimiento que permiten poner en evidencia una evolución de las cepas. Para ello, el crecimiento

de las cepas procedentes de la adaptación se compara con el de la cepa parental I-4215, sobre YNB gluconato (2%) y sobre YNB glucosa (2%) . Los cultivos se siembran a DO 0, 1, a partir de un precultivo de aproximadamente 14h sobre YEPD. Los cultivos se realizan en unos matraces erlenmeyers de 250 ml que contienen 50 ml de medio y se incuban a 28º C bajo agitación (250 rpm) .

Después de 23, 37 y 79 transferencias, que corresponden... [Seguir leyendo]

1. Método de obtención de cepas mutantes de levaduras que tienen una VPP (vía de las pentosas fosfato) amplificada, caracterizada por que comprende las etapas -de cultivo de las cepas sobre un sustrato a base de una sal de ácido glucónico, -de adaptación durante al menos 10 generaciones, a una temperatura de incubación de 16º C a 32º C, preferentemente de 28º C, bajo agitación, -de selección de las cepas adaptadas que han acumulado unas mutaciones que permiten una amplificación de la VPP, por ensayo de crecimiento, sobre los cultivos que tienen una DO superior a al menos 1, 3 veces la de la cepa parental.

2. Mutantes de cepas de levadura que tienen una VPP amplificada con respecto a una cepa parental, caracterizados por que son susceptibles de ser obtenidos por un procedimiento de cultivo que comprende las etapas:

- de adaptación de una cepa de levadura, durante al menos 10 generaciones, utilizando como única fuente de carbono un sustrato a base de gluconato, -de selección de los mutantes que han acumulado unas mutaciones que permiten una amplificación de la VPP, que tienen una DO final de al menos 1, 3 veces superior a la de la cepa parental no sometida a las condiciones de adaptación anteriores, presentando estos mutantes con respecto a una cepa parental un tiempo de fermentación reducido en al menos un 30% y una producción de acetato reducida, en un factor de al menos 2, una producción incrementada, de compuestos aromáticos, tal como el alcohol isoamílico y el acetato de isoamilo, producidos a un índice de al menos 1, 5 veces más con respecto a la cepa parental, y de feniletanol producido a un índice de al menos 2 veces más.

3. Mutantes según la reivindicación 2, caracterizados por que pertenecen al género Saccharomyces, en particular a 30 las especies cerevisiae, bayanus, uvarum o kudriavzevii, de los géneros Saccharomyces, o de híbridos.

4. Cepa mutante de Saccharomyces cerevisiae depositada en la Colección Nacional de Cultivo de Microorganismos (CNCM) , 25 rue du Dr Roux, Paris, con fines de depósito según el tratado de Budapest, bajo el nº CNCM I-4216, el 29 de julio de 2009.

5. Aplicación de las cepas según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en fermentación.