Cepas malolácticas tolerantes al alcohol para la maduración de los vinos de pH medio o elevado.

Cepa seleccionada de bacteria láctica perteneciente al género Lactobacillus o Pediococcus,

que tiene lacapacidad de realizar la conversión del ácido málico en ácido láctico, estando caracterizada dicha bacteria porque cuando se introduce a una concentración comprendida entre 106 y 5.107 UFC/ml, directamente en estado seco,liofilizado o congelado en un vino que tiene un grado de alcohol del 10% o más y un pH superior o igual a 3,5,

i) convierte al menos el 5%, y preferentemente al menos el 10%, del ácido málico en ácido láctico en 5 díasdespués de la inoculación de dicho vino, y

ii) convierte al menos el 10%, y preferentemente al menos el 25%, del ácido málico en ácido láctico en 10 díasdespués de la inoculación de dicho vino.

Cepas malolácticas tolerantes al alcohol para la maduración de los vinos de pH medio o elevado [0001] La presente invención concierne a un procedimiento de control de la fermentación maloláctica en los vinos por inoculación directa de cepas de bacterias lácticas seleccionadas.

Tiene por objeto unas cepas de bacterias lácticas seleccionadas resistentes al alcohol, capaces de iniciar y de realizar una fermentación maloláctica (FML) completa cuando se introducen sin una etapa previa de aclimatación en un vino de pH medio a elevado. Esta resistencia al alcohol se aprovecha en un procedimiento para producir la FML en un vino de pH medio a elevado, igualmente objeto de la presente invención.

La fermentación maloláctica (FML) es la decarboxilación del ácido málico en ácido láctico, como resultado de la actividad metabólica de ciertas bacterias lácticas. Muchas bacterias lácticas que provienen de la superficie de los granos de uva, las hojas de parra, el suelo y del material vinícola están presentes naturalmente en todas las etapas del proceso de vinificación y de almacenamiento del vino. Sin embargo, debido a condiciones limitantes del crecimiento, solo algunos grupos de bacterias lácticas son capaces de multiplicarse en el mosto y sobre todo en el vino. Estas bacterias pertenecen a 4 géneros: Oenococcus, Leuconostoc, Lactobacillus y Pediococcus. Comúnmente, se encuentran en el vino tres especies de Pediococcus y siete especies de Lactobacillus (Kunkee, 1967, Adv. Appl. Microbiol., vol 9, pp. 235-279) , mientras que Leuconostoc y Oenococcus están representados cada uno por una sola especie (Leuconostoc mesenteroides y Oenococcus oeni, respectivamente) .

Se hace referencia a la FML en los artículos científicos: Carbo et al., Riv. Vitic. Envl., vol. 48, Nº 4, 1995, p. 29-38; Carrie et al., Revue des Oenologues, Nº 103, 2002, p. 16-18; Pilone, Wine Industrie Journal, vol. 10, nº 2,

1995, P. 169-173; Lin et al., Am. J. Envl. Vitric., vol. 46, Nº 2, 1995, p. 166-174; Joyeux et al., Connaissance Vigne Vin, vol. 19, Nº 3, 1985, p. 149-159.

La disminución de la acidez y la modificación de los aromas del vino que proceden de la FML se consideran beneficiosos para la calidad del vino. Esta fermentación secundaria contribuye además a la estabilización biológica del vino. Su buena realización reviste por lo tanto gran importancia para la obtención de vinos de calidad, lo que ha llevado a los productores a investigar los medios de controlar su iniciación y su desarrollo.

En la vinificación tradicional, la FML se produce gracias al crecimiento espontáneo de una flora nativa de bacterias lácticas. El proceso de la FML se desencadena por sí mismo, cuando la flora maloláctica está

suficientemente desarrollada, es decir, de manera aleatoria entre el final de la fermentación alcohólica y varias semanas, incluso varios meses, después de la fermentación alcohólica. Cuando las bacterias malolácticas alcanzan una concentración de aproximadamente 106 UFC/ml en el medio, entran en una fase metabólica activa e inician la fermentación del ácido málico. En estas condiciones, el Oenococcus oeni es la especie responsable más frecuentemente de la FML. En efecto, si bien al principio de la fermentación alcohólica se observa una predominancia de las especies homofermentativas Lactobacillus plantarum y Lactobacillus casei, estas desaparecen cuando la cantidad de alcohol aumenta. Después de la fermentación alcohólica son las especies de Pediococcus y Oenococcus, según el pH, las que predominan y alcanzan finalmente la concentración crítica para iniciar la FML.

Se han propuesto varios métodos destinados a controlar mejor el inicio y el desarrollo de la FML, que se 45 basan principalmente en la inducción de la FML por inoculación de los mostos o de los vinos con cepas seleccionadas de bacterias lácticas. En general, se utilizan cepas de Oenococcus oeni, siendo conocida esta especie por ser la más conveniente para la FML.

Un primer procedimiento consiste en inducir la FML con la ayuda de una biomasa no proliferante de Oenococcus oeni. Debido a que las bacterias actúan en este caso como una preparación enzimática, la degradación completa del ácido málico se obtendrá solamente con una inoculación masiva, a razón de al menos 108 UFC/ml, lo que representa un coste demasiado elevado para encontrar una aplicación práctica real.

Un segundo proceso consiste en introducir en la cuba de vinificación preparaciones de Oenococcus oeni,

antes del inicio de la fermentación alcohólica, cuando aún no se ha producido nada de alcohol y el mosto es rico en nutrientes. Este método tiene la ventaja de que las preparaciones pueden añadirse directamente al mosto en estado liofilizado o congelado sin tener que sufrir estrés alcohólico, lo cual sería muy perjudicial. Pero los resultados no han sido satisfactorios, principalmente debido a la competición entre las levaduras y las bacterias lácticas: una de las dos poblaciones se multiplica más rápidamente y puede suplantar a la otra, principalmente por la influencia del pH del medio. Por otro lado, Oenococcus oeni, al ser heterofermentativo, puede utilizar el azúcar como sustrato para producir ácido láctico. Por tanto, el riesgo de obtener una producción de ácidos volátiles por las bacterias lácticas es muy disuasivo para los viticultores (Riberau-Gayon et al., 1975, Sciences et techniques du vin, Tomo III, Dunod, Paris) .

Frente a este problema, se ha recurrido a cepas homofermentativas de Lactobacillus plantarum, de forma que no haya producción de ácido acético a partir de los azúcares presentes en el mosto o en el zumo de frutas, y por tanto no haya aumento de la acidez volátil en el vino (solicitud de patente EP 0 398 957) . Las cepas seleccionadas se introducen en el mosto o el zumo de fruta antes o en los primeros momentos de la FA. Sin embargo, como estas bacterias malolácticas son incapaces de sobrevivir en un vino fermentado, la degradación del ácido málico se ralentiza y se detiene cuando el nivel de alcohol alcanza el 5%. Al final, el ácido málico no se degrada totalmente y el

vino obtenido no es estable desde el punto de vista bacteriológico.

Otra solución para evitar la producción de acidez volátil a partir de los azúcares puede consistir en añadir las bacterias al vino solo después de la fermentación alcohólica, cuando la tasa de azúcar es mínima. Las preparaciones de bacterias lácticas inoculadas en las cubas de vinificación deben ser, en este caso, capaces de sobrevivir a pesar del estrés debido a un grado de alcohol ya elevado en el medio, siendo además esas bacterias lácticas más sensibles al estrés que las que se introducen en el medio en estado liofilizado o congelado.

Se han comercializado preparaciones de Oenococcus oeni desde hace varios años para la adición de bacterias al vino tras la fermentación alcohólica. Se ha preconizado un precultivo en un medio enriquecido con vino,

para evitar la caída importante de la población celular cuando se inocula en un medio alcohólico. Por ejemplo, una incubación a 25 ºC durante 1 a 6 días, permite mejorar la supervivencia de las bacterias situándolas en un estado fisiológico adaptado. Esta “reactivación”, también llamada “aclimatación”, debe permitir una inducción de los mecanismos de resistencia de las células frente a un nivel de alcohol elevado, permitiendo un aumento de la población bacteriana y una recuperación de la actividad metabólica (Lafon-Fourcade et al., 1993, Conn. Vigne Vin, vol 17, pp. 55-71) . Este método, aunque es eficaz, requiere tiempo y trabajo y se necesitan ciertos conocimientos microbiológicos. Los tiempos de precultivo y el momento de la introducción deben respetarse con precisión so pena de una pérdida significativa de viabilidad, lo que representa un serio contratiempo durante el periodo de las vendimias.

Más recientemente, se ha explorado otra vía para disponer de preparaciones de bacterias lácticas que respondan a la doble exigencia de poder ser inoculadas en el vino en forma liofilizada o congelada, sin pérdida de viabilidad a pesar del grado alcohólico, lo que permite en particular realizar la FML en periodos más cortos sin aumentar la biomasa aportada. La patente EP 635 050 describe un procedimiento de inducción de la fermentación maloláctica por inoculación a un vino de un cultivo liofilizado de bacterias lácticas que pertenecen al género Oenococcus oeni resistentes al alcohol, sin la etapa previa de aclimatación. Las cepas seleccionadas de Oenococcus oeni presentan una tasa de supervivencia elevada que hace posible el inicio de la FML con unas concentraciones básicas de aporte (de 1.106 a 5.107... [Seguir leyendo]

1. Cepa seleccionada de bacteria láctica perteneciente al género Lactobacillus o Pediococcus, que tiene la capacidad de realizar la conversión del ácido málico en ácido láctico, estando caracterizada dicha bacteria por

que cuando se introduce a una concentración comprendida entre 106 y 5.107 UFC/ml, directamente en estado seco, liofilizado o congelado en un vino que tiene un grado de alcohol del 10% o más y un pH superior o igual a 3, 5,

i) convierte al menos el 5%, y preferentemente al menos el 10%, del ácido málico en ácido láctico en 5 días después de la inoculación de dicho vino, y

ii) convierte al menos el 10%, y preferentemente al menos el 25%, del ácido málico en ácido láctico en 10 días después de la inoculación de dicho vino.

2. Cepa de bacteria láctica según la reivindicación 1, que se caracteriza por que cuando se introduce en una concentración comprendida entre 106 y 5.107 UFC/ml, directamente en estado seco, liofilizado o congelado en un 15 vino que tiene un grado de alcohol del 10% o más y un pH superior o igual a 3, 6:

iii) convierte al menos el 10%, y preferentemente al menos el 15%, del ácido málico en ácido láctico en 5 días después de la inoculación de dicho vino, y iv) convierte al menos el 25%, y preferentemente al menos el 40%, del ácido málico en ácido láctico en 10 días después de la inoculación de dicho vino.

3. Cepa de bacteria láctica según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que se caracteriza por que es homofermentativa,

4. Cepa de bacteria maloláctica según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que posee además una o varias de las siguientes características:

- no produce aminas biógenas a partir de precursores aminados,

- no degrada el glicerol.

30. no degrada el ácido tartárico.

5. Cepa de bacteria láctica según la reivindicación 4, que se caracteriza por que tiene la capacidad, cuando se introduce directamente a una concentración de 2.106 UFC/ml en un vino a una temperatura superior o igual a 18 ºC,

que tiene una cantidad de SO2 comprendida entre 0 y 15 mg/l, una cantidad de alcohol superior o igual al 10%, y un pH de 3, 7 o más i) de convertir el 15% del ácido málico en ácido láctico en 5 días después de la inoculación de dicho vino, y ii) de convertir el 40% del ácido málico en ácido láctico en 10 días después de la inoculación de dicho vino.

6. Cepa de bacteria láctica según la reivindicación 4, que se caracteriza por que tiene la capacidad, cuando se introduce directamente a una concentración de 2.106 UFC/ml en un vino a una temperatura superior o igual a 18 ºC, que tiene una cantidad en SO2 comprendida entre 0 y 15 mg/l, una cantidad de alcohol superior o igual al 10%, y un pH de 3, 7 o más 45 i) de convertir el 50% del ácido málico en ácido láctico en 5 días después de la inoculación de dicho vino, y ii) de convertir el 80% del ácido málico en ácido láctico en 10 días después de la inoculación de dicho vino.

7. Cepa de bacteria maloláctica según cualquiera de las reivindicaciones precedentes seleccionada del grupo 50 formado por Lactobacillus plantarum, Lactobacillus casei, Lactobacillus delbrückii, Pediococcus acidilactici, Pediococcus damnosus, Pediococcus pentosaceus, Pediococcus parvulus, Pediococcus cerevisiae.

8. Cepa de bacteria maloláctica según la reivindicación precedente elegida del grupo compuesto por Lactobacillus plantarum CNCM I-2924 o Pediococcus acidilactici CNCM MA 18/5M. 55

9. Preparación de bacterias lácticas que comprende una o varias cepas según cualquiera de las reivindicaciones precedentes.

10. Procedimiento de conversión del ácido málico en ácido láctico en un vino que tiene un pH superior o igual a 3, 5,

que consiste en introducir una preparación de bacterias lácticas según la reivindicación 9, directamente en estado seco, liofilizado o congelado en dicho vino, a una concentración comprendida entre 106 y 5.107 UFC/ml, a una temperatura superior o igual a 18 ºC, cuando el grado de alcohol ha alcanzado al menos el 10%, y mantener el vino en condiciones que permiten el desarrollo de la FML, para obtener un vino maduro que tenga una cantidad de ácido málico inferior a 0, 2 g/l.

11. Procedimiento de conversión del ácido málico en ácido láctico en un vino que tiene un pH superior o igual a 3, 5, que consiste en introducir una preparación de bacterias lácticas que comprende una o varias cepas según la reivindicación 3, directamente en estado seco, liofilizado o congelado en dicho vino, a una concentración comprendida entre 106 y 5.107 UFC/ml, a una temperatura superior o igual a 18 ºC, cuando el grado de alcohol ha alcanzado al menos el 5%, y mantener el vino en condiciones que permitan el desarrollo de la FML, para obtener un vino maduro que tenga una cantidad de ácido málico inferior a 0, 2 g/l.

12. Procedimiento de conversión del ácido málico en ácido láctico según cualquiera de las reivindicaciones 10 u 11,

en el que dicha preparación posee además una o varias de las características siguientes: 10

- no produce aminas biógenas a partir de precursores aminados,

- no degrada el glicerol,

- no degrada el ácido tartárico.

13. Procedimiento de conversión del ácido málico en ácido láctico según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, en el que dicha preparación comprende una o varias cepas de bacterias malolácticas seleccionadas del grupo formado por Lactobacillus plantarum, Lactobacillus casei, Lactobacillus delbrückii, Pediococcus acidilactici, Pediococcus damnosus, Pediococcus pentosaceus, Pediococcus parvulus, Pediococcus cerevisiae.

14. Procedimiento de conversión del ácido málico en ácido láctico según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, en la que dicha preparación comprende una o varias cepas de bacterias malolácticas seleccionadas del grupo compuesto por Lactobacillus plantarum CNCM I-2924 y Pediococcus acidilactici CNCM MA 18/5M.

15. Procedimiento según la reivindicación 14, en el que una preparación de bacterias malolácticas que comprende Lactobacillus plantarum CNCM I-2924 se añade a un vino con un pH superior o igual a 3, 9 cuya concentración de alcohol es superior al 11%.

16. Procedimiento según la reivindicación 14, en el que una preparación de bacterias malolácticas que comprende Pediococcus acidilactici CNCM MA-18/5M se añade a un vino con un pH superior o igual a 3, 7 cuya concentración 30 de alcohol es superior al 12%.