Método para amplificar la detección de dianas en una matriz de cristal líquido alineado.

La presente invención se refiere a un método para amplificar la detección de dianas en una matriz de cristal líquido alineado y a un dispositivo para la detección amplificada de dianas que comprende:

uno o más elementos de unión con la capacidad de formar un complejo con una diana, cristal líquido, y medios de polarización configurados para visualizar el alineamiento del cristal líquido. El dispositivo está caracterizado porque comprende medios de flujo con la capacidad de poner en contacto dinámico dicho cristal líquido con los mencionados elementos de unión. Los métodos de detección amplificada están basados en el contacto dinámico entre un flujo de cristal líquido y elementos de unión con capacidad de formar complejos con la diana.

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MÉTODO PARA AMPLIFICAR LA DETECCIÓN DE DIANAS EN UNA MATRIZ DE CRISTAL LÍQUIDO ALINEADO

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se encuadra en el campo de la detección de microorganismos (bacterias, virus y otros microbios) , micropartículas, biomoléculas o cualquier tipo de diana susceptible de ser detectada con una molécula de biorreconocimiento, en matrices de cristal líquido. Mediante el uso de un nuevo mecanismo de amplificación, se consigue un aumento significativo en la sensibilidad de detectores basados en cristales líquidos.

ESTADO DE LA TÉCNICA

La primera mención del uso de dispositivos basados en cristal líquido como sensores aparece en el artículo: V.K. Gupta, J.J. Skaife, T.B. Dubrovsky, N.L. Abbott, "Optical amplification of ligand-receptor binding using liquid cr y stals", Science vol. 279 (5359) , 1998, y la solicitud de patente US 2002/0142453 A, en los cuales se muestra el desalineamiento que se produce en una célula de cristal líquido por el cambio de rugosidad de sus superficies de alineamiento. Se describen las distorsiones causadas en el cristal líquido por dianas que se han unido específicamente a un receptor. Las zonas en las que no hay diana aparecen oscuras, mientras que en las zonas en donde se han unido dianas se produce desalineamiento del cristal líquido, causando la aparición de puntos brillantes en el fondo oscuro. El tamaño de dichos puntos es mayor que las propias dianas. Desde entonces, se han buscado materiales y metodologías que mejoren estos sistemas, dotándolos de una mayor sensibilidad y fiabilidad.

Así, en la solicitud de patente WO 2007/036905 A2 (C. Woolverton, 2007) se describe un sensor de cristal líquido, en el que se emplean micropartículas superparamagnéticas suspendidas dentro del mismo. La unión de partículas diana a estas micropartículas produce un cambio en el alineamiento del cristal líquido, causando la aparición de puntos brillantes en un fondo oscuro cuando se observan las células entre polarizadores cruzados con la ayuda de un microscopio.

En la patente US 6, 411, 354 B1 (O.D. Lavrentovich, T. Ishikawa, 2002) , se detallan formas para alinear un tipo específico de cristales líquidos (cristales líquidos liotrópicos cromónicos) , para la fabricación de células de cristal líquido con aplicaciones, por ejemplo, a biosensores.

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También se conoce la detección de dianas específicas en la interfase entre un cristal líquido termotrópico, generalmente hidrófobo, y una muestra acuosa que incluye la diana que se pretende detectar. La unión de la diana al receptor modifica la superficie, alterando el alineamiento del cristal líquido. Éste pasa de estar alineado perpendicularmente a la interfase a estar alineado en paralelo, señalando así la presencia de la diana al colocar polarizadores cruzados. Esta tecnología está relacionada con la publicación original: J.M. Brake, M.K. Daschner, Y.Y. Luk, y N.L. Abbott, "Biomolecular interactions at phospholipiddecorated surfaces of liquid cr y stals", Science vol. 302 (2094) , 2003, y con la solicitud del mismo autor US 2010/233729 A1. En algunos casos, se emplea una gota de cristal líquido depositada sobre un único sustrato; en otros, el cristal líquido se deposita en una pluralidad de pozos que se exponen a la muestra acuosa.

Estas técnicas de detección prometen avances importantes, aunque todavía requieren mejoras, por ejemplo, en su sensibilidad, fiabilidad o simplicidad de uso. El mayor problema de los métodos mencionados es que el factor de amplificación que se obtiene es raramente superior a unas decenas de veces del tamaño de la diana. Esto implica que la detección de micropartículas requiere el uso de un microscopio o un sistema de lentes. El uso de aparatos de microscopía no solo incrementa el coste del sistema de detección, además reduce el área de inspección a pocos milímetros cuadrados. Reducir el área de inspección puede reducir significativamente la sensibilidad del sistema, ya que se encontrará un número menor de dianas ligadas al sustrato. El uso de un microscopio, además, suele incluir un sistema microfluídico que es incompatible con muestras muy viscosas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

Los inventores han diseñado un dispositivo y procedimiento mejorado para la detección de dianas, basados en cristales líquidos. A diferencia de otros, este procedimiento es más sensible, no requiere instrumentación adicional, y en consecuencia resulta de manejo más sencillo.

Es por tanto un primer aspecto de la presente invención un dispositivo para la detección amplificada de dianas que comprende: uno o más medios de unión con la capacidad de formar un complejo con una diana, cristal líquido, y medios de polarización de luz configurados para visualizar el alineamiento de dicho cristal líquido, caracterizado porque comprende medios de flujo con la capacidad de poner en contacto dinámico dicho cristal líquido y dichos medios de unión.

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Un segundo aspecto es el método para la detección de una diana en una muestra, caracterizado porque comprende (i) poner en contacto la muestra con uno o más medios de unión con capacidad de unirse a dicha diana, (ii) accionar medios de flujo para crear un flujo de cristal líquido que contacte con los medios de unión, (iii) visualizar el alineamiento del cristal líquido mediante medios de luz polarizada, de forma que, en caso de estar la diana presente en la muestra, se observe una o más áreas de desalineamiento en el cristal líquido.

La presente invención introduce un método de amplificación de la señal de varios centenares de veces el tamaño de la diana. La invención supone un significativo avance, porque se modifica el instrumental e incluso el área de aplicación de los biosensores de cristal líquido. Ya no resulta necesario un sistema de microscopía y se pueden inspeccionar grandes áreas, incluso con distintos receptores (aptámeros, anticuerpos, proteínas, ..) en el mismo dispositivo.

El método y dispositivo de la presente invención hace uso de las distorsiones provocadas en una matriz de cristal líquido en flujo por la presencia de un cuerpo que modifica su alineamiento. El sensor se basa en la detección óptica o eléctrica de este desalineamiento.

En los sensores conocidos hasta el momento, la detección y el contacto entre el complejo diana/receptor y el cristal líquido no implicaba ningún flujo, y la detección se basaba en la distorsión ejercida sobre el cristal líquido en reposo. Al realizar la detección mientras el cristal líquido está en contacto dinámico con la muestra, se produce una amplificación significativamente mayor que en otros métodos. En consecuencia, el dispositivo y método de la presente invención difiere considerablemente de otros ya existentes, y proporciona una amplificación del desalineamiento del cristal líquido en la matriz muy superior a la de los dispositivos conocidos hasta la fecha. El método de detección se basa en la observación de un flujo para detectar interferencias en el flujo lineal de una matriz alineada.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

La figura 1 muestra una realización particular de un dispositivo de la invención en el que las moléculas de cristal líquido (4) se encuentran alineadas en ausencia de la diana y la muestra aparece completamente oscura (6) . Los sustratos A y B presentan una capa de alineamiento (1) , y una capa de funcionalización para dianas específicas (2) . Entre ambas se sitúan espaciadores (3) de tamaño calibrado micrométrico y, en ambos extremos, unos polarizadores cruzados, uno de ellos alineado en la dirección de flujo. La flecha (5) muestra la dirección de flujo del cristal líquido.

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La figura 2 muestra el mismo dispositivo de la figura 1, pero en el que la presencia de una diana (7) produce un flujo perturbado (8) , desalineando las moléculas del cristal líquido y produciendo una señal (10) , al ser observado entre polarizadores cruzados.

La figura 3 es análoga a la figura 1, pero en este caso el alineamiento original del cristal líquido es homeotrópico (perpendicular) .

La figura 4 es análoga a la figura 2, pero en este caso el alineamiento original del cristal líquido es homeotrópico (perpendicular) .

Las figuras 5, 6 y 7 son fotografías de algunos resultados obtenidos con dispositivos y métodos de acuerdo con la presente invención. En todos los casos, se aplica un flujo del cristal líquido liotrópico Sunset Yellow y se observan los resultados entre polarizadores cruzados. Las dianas que se han detectado tienen un tamaño entre 2 a 12 micrómetros de diámetro. Se observa un desalineamiento muy acentuado...

1. Un dispositivo para la detección amplificada de dianas que comprende: uno o más medios de unión fijados en el dispositivo, con la capacidad de formar un complejo con una diana, medios para iniciar e introducir un flujo de cristal líquido hacia los medios de unión en una dirección preferencial dentro del dispositivo, y medios de polarización de luz configurados para visualizar el alineamiento de dicho cristal líquido.

2. El dispositivo según la reivindicación 1, caracterizado porque los medios de unión se seleccionan del grupo que consiste en: anticuerpos, aptámeros, ADN, ARN y proteínas, y fragmentos funcionales de los mismos, que contienen zonas específicas de unión a las dianas.

3. El dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque la diana está unida a grupos secundarios de forma específica aumentando la sensibilidad de la detección o la especificidad de la diana.

4. El dispositivo según la reivindicación 3, caracterizado porque dichos grupos secundarios son enzimas.

5. El dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 3 ó 4, caracterizado porque

dichas uniones específicas a grupos secundarios degradan compuestos específicos del cristal líquido.

6. El dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, caracterizado porque dichas uniones específicas a grupos secundarios están asociadas a una micropartícula.

7. El dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque el

cristal líquido se selecciona del grupo que consiste en cristales líquidos termotrópicos, liotrópicos, liotrópicos cromónicos y mezclas de los mismos.

8. El dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque la diana se selecciona del grupo que consiste en micropartículas, proteínas, ADN, ARN, microorganismos y fragmentos de los mismos.

9. El dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque dichos medios de flujo se seleccionan del grupo que consiste en inyección microfluídica directa, presión positiva, presión negativa, capilaridad, fuerza centrífuga y una mezcla de los mismos.

10. El dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque 35 comprende un primer sustrato plano con una primera cara exterior y una primera cara 12

interior, y un segundo sustrato con una segunda cara exterior y una segunda cara interior en donde al menos uno de los sustratos es total o parcialmente transparente.

11. El dispositivo según la reivindicación 10, caracterizado porque, al menos una de las caras interiores, comprende medios de unión formando una capa de funcionalización, y porque, al menos una de las caras interiores, comprende una capa de alineamiento configurada para inducir el alineamiento de las moléculas del cristal líquido.

12. El dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 10 u 11, caracterizado porque el primer sustrato y el segundo sustrato están separados por una distancia de entre 1 y 1000 µm.

13. El dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado por comprender dos o más medios de unión distintos con la capacidad de formar complejos con una o más dianas.

14. El dispositivo según la reivindicación 13, caracterizado por comprender dos o más elementos de unión con la capacidad de formar complejos con dos o más dianas específicas distintas.

15. El dispositivo según la reivindicación 14, caracterizado porque cada uno de dichos dos

o más medios de unión se encuentra en una región distinta del primer sustrato.

16. El dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, caracterizado porque en una de sus regiones no se fijan elementos de unión

17. El dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, caracterizado porque comprende medios de visualización y grabado que se seleccionan entre cámaras, vídeos y lentes.

18. Método para la detección de una diana en una muestra, caracterizado porque comprende (i) poner en contacto la muestra con uno o más medios de unión con capacidad de unirse a dicha diana, (ii) accionar medios de flujo para crear un flujo de cristal líquido que contacte con los medios de unión, (iii) visualizar el alineamiento del cristal líquido mediante medios de luz polarizada, de forma que, en caso de estar la diana presente en la muestra, se observe una o más áreas de desalineamiento en el cristal líquido.

19. El método según la reivindicación 18, caracterizado porque la detección tiene lugar al mismo tiempo que el flujo de cristal líquido.

20. El método según la reivindicación 18, caracterizado porque la detección tiene lugar hasta 60 minutos después de finalizar el flujo de cristal líquido.

21. El método según cualquiera de las reivindicaciones 19 ó 20, caracterizado porque después de la etapa (i) , y antes de la etapa (ii) , se lava con una disolución tampón.

22. El método según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21, caracterizado porque, en dicha muestra, se incuba la muestra con grupos secundarios según reivindicaciones 3, 4 ó 6 antes de la etapa (i) .

23. El método según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21, caracterizado porque, en dicha muestra, se incuba la muestra con grupos secundarios según reivindicaciones 3, 4 ó 6 antes de la etapa (ii) .