Método de diagnóstico del acné usando biomarcadores de lesiones y método de cribado in vitro para identificar sus moduladores.

Método de diagnóstico del acné o método de seguimiento de la evolución de una enfermedad de acné o de una hiperseborrea usando la expresión de genes o biomarcadores/productos de expresión génica seleccionados de la lista siguiente:

receptor 1 de quimioquinas (resto C-C) (CCR1); receptor 2 de quimioquinas (resto C-C) /// receptor 2 de quimioquinas (resto C-C) (CCR2); receptor 5 de quimioquinas (resto C-C) (CCR5), comprendiendo dicho método la etapa de comparar la expresión de dichos genes, o la actividad de los productos de expresión génica, en una muestra biológica de un paciente con una muestra biológica de un sujeto "de control".

La presente invenciïn se refiere a la identificaciïn de modelos de biomarcadores/productos de expresiïn gïnica de lesiones del acnï y en particular biomarcadores de lesiones del acnï inflamatorio y sus usos en el mïtodo de diagnïstico del acnï, y a mïtodos de cribado para identificar sus moduladores y al mïtodo de determinaciïn in vitro de la sensibilidad de pacientes para desarrollar lesiones de acnï.

El acnï es la enfermedad cutïnea mïs comïn que afecta a millones de personas en todo el mundo. Los pacientes con acnï grave se enfrentan con frecuencia a problemas psicolïgicos y emocionales significativos debido a las cicatrices asociadas con la enfermedad. La patogenia del acnï comïn es compleja y no del todo comprendida.

La patogenia del acnï se ha relacionado con mïltiples factores, tales como aumento de la producciïn de sebo, inflamaciïn, hiperqueratinizaciïn folicular y la acciïn de Propionibacterium acnes dentro del folïculo.

La inflamaciïn es un componente clave de la patogenia del acnï. Una reacciïn inmunolïgica al microbio grampositivo P. acnes puede desempeïar un papel importante en la iniciaciïn de la reacciïn inflamatoria (De Young et al., 1984; Jappe et al., 2002) . Estudios recientemente publicados implican tambiïn en el acnï inflamatorio al receptor de tipo Toll 2 (TLR-2, por la expresiïn inglesa Toll Like receptor 2) .

El Propionibacterium acnes desencadena la liberaciïn de citoquinas pro-inflamatorias en las cïlulas inflamatorias por medio de la activaciïn de TLR-2, que a su vez inicia una cascada de seïalizaciïn intracelular que da como resultado la transcripciïn de genes, tales como la interleuquina-12 y la interleuquina-8 (Kim et al., 2002) . Ademïs, el

P. acnes viable y los microorganismos no muertos por calor, pueden estimular la liberaciïn de citoquinas, tales como la IL-1º, la fraccbïn estimulante de colonias de granulocitos/macrïfagos (GM -CSF) y la IL-8 (Nagy et al., 2005; Schaller et al., 2005) .

Aunque el evento exacto de iniciaciïn que provoca el acnï sigue siendo un misterio, existe el debate sobre si la hiperqueratinizaciïn del conducto folicular precede a la afluencia de cïlulas inflamatorias o viceversa. Estudios recientes apoyan esta ïltima hipïtesis demostrando que se produce un aumento de la actividad de la IL-1 antes de la hiperproliferaciïn alrededor de los folïculos no implicados y esto desencadena el “ciclo de activaciïn de los queratinocitos”. (Freedberg et al., 2001; Jeremy et al., 2003)

Informes recientes demuestran que la piel expresa diversos pïptidos antimicrobianos en respuesta a la proliferaciïn de patïgenos como parte de la inmunidad innata cutïnea (Braff et al., 2005; Schroder, 2004; Selsted and Ouellette, 2005) . Entre este grupo de agentes antimicrobianos estïn incluidos principalmente miembros de la familia defensinas humanas y pïptidos derivados de la granulisina (Deng et al., 2005; Harder et al., 2004; Mclnturff et al., 2005) . Las º-defensinas 1 y 2 humanas (HBD-1 y HBD-2) se expresan en la unidad pilosebïcea y su expresiïn estï sobre-regulada en las lesiones de acnï (Chronnell et al., 2001) . Estudios recientes tambiïn han descubierto que cepas seleccionadas de P. acnes pueden activar la HBD-2 a travïs de los TLR, lo que confirma aïn mïs la importancia de estos pïptidos en el acnï inflamatorio (Nagy et al., 2005) .

El documento US2003211105 describe un mïtodo para identificar compuestos que inhiben el crecimiento tumoral y/o la metïstasis en un sujeto y un mïtodo para tratar cïncer usando el receptor de MCP1 o MCP2.

El documento de Gao et al., 2003, Chem. Rev., 103, 3733-3752, 10 de septiembre de 2009, describe un estudio sobre la quïmica de los receptores de quimioquinas y sus ligandos, y un mïtodo para identificarlos.

El documento WO02/43758 describe un mïtodo de cribado de compuestos candidatos para el tratamiento de enfermedades inflamatorias cutïneas, tales como el lupus eritematoso o la dermatitis atïpica, y que comprende la determinaciïn de la capacidad de un compuesto para modular la expresiïn de las quimioquinas.

El documento de Jugeau et al., 2005, Brit. J. Derm, 153 (6) , 1105-1113, describe el aumento de la expresiïn de TLR2 y TLR-4 en las lesiones de acnï y establece un vïnculo entre varios receptores de tipo Toll y el acnï.

La investigaciïn sobre el acnï durante los ïltimos 25 aïos ha aumentado considerablemente nuestra comprensiïn sobre los factores etiolïgicos que dan lugar al acnï. Sin embargo, con la apariciïn del perfil de expresiïn gïnica en biochip, han surgido nuevas oportunidades para volver a examinar la enfermedad e identificar potencialmente nuevas dianas para su tratamiento.

Por lo tanto, es necesario identificar los genes especïficos expresados en las lesiones del acnï inflamatorio en comparaciïn con la piel normal de pacientes con acnï y probar la hipïtesis de que existen diferencias en la expresiïn gïnica entre la piel normal de pacientes con acnï y la piel de sujetos sin acnï que puede explicar la predisposiciïn a la enfermedad y cuando aparece el acnï establecer nuevas terapias capaces de modular/regular la expresiïn gïnica.

En un intento de comprender los genes especïficos implicados en el acnï inflamatorio, los autores de la presente invenciïn han realizado perfiles de expresiïn gïnica en pacientes con acnï. Las biopsias de piel se obtuvieron de una pïpula inflamatoria y de piel normal de 6 pacientes con acnï. Las biopsias tambiïn se tomaron de piel normal de 6 sujetos sin acnï. El perfil de expresiïn gïnica en biochip se realizï utilizando chips Affymetrix U133A, comparando piel con lesiones y sin lesiones en pacientes con acnï y comparando piel sin lesiones de pacientes con acnï con la piel de sujetos normales. Dentro de los pacientes con acnï estaban sobre-regulados 211 genes en piel con lesiones en comparaciïn con piel sin lesiones. Una proporciïn significativa de estos genes estï implicada en las vïas que regulan la inflamaciïn y la remodelaciïn de la matriz extracelular e incluyen las metaloproteinasas de matriz 1 y 3, la bnterleuqubna 8, la -defensina 4 humana y la granzima B. Estos datos indican un papel destacado en las lesiones de acnï de las metaloproteinasas de matriz, las citoquinas inflamatorias y los pïptidos antimicrobianos. Estos estudios son los primeros en describir los cambios globales de la expresiïn gïnica en las lesiones del acnï inflamatorio y como tal pueden ser de utilidad en la identificaciïn de potenciales dianas terapïuticas en el acnï inflamatorio.

Por lo tanto, se propone tener como dianas los genes antes mencionados y/o los productos de expresiïn de los genes para prevenir y/o tratar el acnï, asï como los trastornos asociados al acnï (por ejemplo, la hiperseborrea) .

Por acnï se entiende todas las formas de acnï, especialmente acnï simple, acnï comedoniano, acnï papulopustuloso, acnï papulocomedoniano, acnï noduloquïstico, acnï conglobata, acnï queloide de la nuca, acnï miliar recurrente, acnï necrïsico, acnï neonatal, acnï ocupacional, rosïcea, acnï senil, acnï solar y acnï relacionado con la medicaciïn.

En el contexto de la presente invenciïn, “gen” se refiere a un ïcido nucleico o secuencia de nucleïtidos que codifica una expresiïn de proteïna/biomarcador. Dicho gen se considera tambiïn como un gen "diana" para el que se busca un modulador.

Cuando la diana es preferiblemente un gen humano o su producto de expresiïn, la invenciïn podrïa utilizar cïlulas que expresen el gen o la proteïna/biomarcador asociado por incorporaciïn genïmica o por una proteïna que codifica la expresiïn gïnica transitoria.

Referencias de secuencias humanas correspondientes se recogen en las Tablas 1 y 2.

Por lo tanto, la presente invenciïn se refiere a biomarcadores y/o productos de expresiïn gïnica de lesiones de acnï como biomarcadores de lesiones de acnï seleccionados de la siguiente lista:

Metaloproteinasa de la matriz 1 (MMP1) ; metaloproteinasa de la matriz 3 (MMP3) ; interleuquina 8 (IL8) ; beta defensina 4 (DEFB4) ; inhibidor 3 de proteasas derivadas de la piel (SKALP) (PI3) ; ligando 2 de quimioquinas (resto C-X-C) (CXCL2) ; enzima editora del mRNA de la apolipoproteïna B (APOBEC3A) ; superïxido-dismutasa 2 (SOD2) mitocondrial; granzima B (GZMB) ; proteïna de uniïn al calcio S100A9 (calgranulina B) (S100A9) ; receptor 1 de quimioquinas (resto C-C) (CCR1) ; heparanasa (HPSE) ; proteïna amiloide sïrica A2 (SAA2) ; receptor de leucotrieno B4 (LTB4R) ; miembro 1B de la superfamilia de receptores del factor de necrosis tumoral (TNFRSF1B) ; receptor 1 del componente 3a del complemento (C3AR1) ; receptor 65 acoplado a la proteïna... [Seguir leyendo]

1. Mïtodo de diagnïstico del acnï o mïtodo de seguimiento de la evoluciïn de una enfermedad de acnï o de una hiperseborrea usando la expresiïn de genes o biomarcadores/productos de expresiïn gïnica seleccionados de la lista siguiente: receptor 1 de quimioquinas (resto C-C) (CCR1) ; receptor 2 de quimioquinas (resto C-C) /// receptor 2 de quimioquinas (resto C-C) (CCR2) ; receptor 5 de quimioquinas (resto C-C) (CCR5) , comprendiendo dicho mïtodo la etapa de comparar la expresiïn de dichos genes, o la actividad de los productos de expresiïn gïnica, en una muestra biolïgica de un paciente con una muestra biolïgica de un sujeto "de control".

2. Mïtodo de diagnïstico del acnï de acuerdo con la reivindicaciïn 1, caracterizado por que el acnï comprende acnï simple, acnï comedoniano, acnï papulopustuloso, acnï papulocomedoniano, acnï noduloquïstico, acnï conglobata, acnï queloide de la nuca, acnï miliar recurrente, acnï necrïsico, acnï neonatal, acnï ocupacional, rosïcea, acnï senil, acnï solar y acnï relacionado con la medicaciïn.

3. Mïtodo de cribado in vitro de un fïrmaco candidato susceptible de prevenir y/o tratar el acnï, asï como la hiperseborrea, que comprende determinar la capacidad de dicho candidato para inhibir o sub-regular la expresiïn de un gen seleccionado o la actividad de dicho producto de expresiïn gïnica seleccionado elegido de la lista siguiente: receptor 1 de quimioquinas (resto C-C) (CCR1) ; receptor 2 de quimioquinas (resto C-C) /// receptor 2 de quimioquinas (resto C-C) (CCR2) ; y receptor 5 de quimioquinas (resto C-C) (CCR5) .

4. Mïtodo de cribado in vitro de un fïrmaco candidato de acuerdo con la reivindicaciïn 3, que comprende las

siguientes etapas: a) recoger al menos dos muestras biolïgicas: una que representa la lesiïn del acnï y otra que representa el estado sano; b) poner en contacto al menos una muestra o una mezcla de muestras con uno o mïs fïrmacos candidatos que se han de analizar; c) medir la expresiïn gïnica o el nivel o la actividad del producto de expresiïn gïnica en las muestras biolïgicas o en las mezclas obtenidas en b) ; seleccionïndose dicho producto de expresiïn gïnica de la lista siguiente: receptor 1 de quimioquinas (resto C-C) (CCR1) ; receptor 2 de quimioquinas (resto C-C) /// receptor 2 de quimioquinas (resto C-C) (CCR2) ; y receptor 5 de quimioquinas (resto C-C) (CCR5) ; y d) seleccionar fïrmacos candidatos que sean capaces de modular la expresiïn gïnica o el nivel o la actividad del producto de expresiïn gïnica medido en dichas muestras o mezclas obtenidas en b) y comparar los niveles con una muestra no mezclada con el fïrmaco candidato.

5. Mïtodo de acuerdo con la reivindicaciïn 4, en el que los fïrmacos candidatos en la etapa d) son inhibidores de productos de expresiïn gïnica sobre-regulados que se seleccionan de la siguiente lista: receptor 1 de quimioquinas (resto C-C) (CCR1) ; receptor 2 de quimioquinas (resto C-C) /// receptor 2 de quimioquinas (resto C-C) (CCR2) ; y receptor 5 de quimioquinas (resto C-C) (CCR5) .

6. Mïtodo de acuerdo con las reivindicaciones 3 a 5, caracterizado por que el acnï comprende acnï simple, acnï comedoniano, acnï papulopustuloso, acnï papulocomedoniano, acnï noduloquïstico, acnï conglobata, acnï queloide de la nuca, acnï miliar recurrente, acnï necrïsico, acnï neonatal, acnï ocupacional, rosïcea, acnï senil, acnï solar y acnï relacionado con la medicaciïn.

7. Mïtodo de determinaciïn in vitro de la sensibilidad de un paciente para desarrollar lesiones de acnï y/o una hiperseborrea, que comprende la etapa de comparar la expresiïn gïnica o los niveles de productos de expresiïn gïnica o la actividad de biomarcadores seleccionados de la lista siguiente: receptor 1 de quimioquinas (resto C-C) (CCR1) ; receptor 2 de quimioquinas (resto C-C) /// receptor 2 de quimioquinas (resto C-C) (CCR2) ; y receptor 5 de quimioquinas (resto C-C) (CCR5) en una muestra biolïgica de un paciente con una muestra biolïgica de un sujeto “de control”.

8. Mïtodo de determinaciïn in vitro de acuerdo con la reivindicaciïn 7, caracterizado por que el acnï comprende acnï simple, acnï comedoniano, acnï papulopustuloso, acnï papulocomedoniano, acnï noduloquïstico, acnï conglobata, acnï queloide de la nuca, acnï miliar recurrente, acnï necrïsico, acnï neonatal, acnï ocupacional, rosïcea, acnï senil, acnï solar y acnï relacionado con la medicaciïn.

Tabla 3: Expresiïn aumentada de los genes implicados en la inflamaciïn y en la remodelaciïn de la matriz en lesiones de acnï

Cambio mïltiplo en la expresiïn de mRNA en muestras de biopsias de una lesiïn de acnï inflamatorio comparado con piel clïnicamente normal

Valor medio Error estïndar

MMP-1 +170 ï 18

MMP-3 +165 ï 32

IL-8 +935 ï 338

HBD-4 +167 ï 20

Granzima B +16 ~ 2