Método de determinación de megalina humana.

Método para detectar nefropatía mediante la determinación de una cantidad aumentada de megalina humana en una muestra de orina usando un primer ligando que puede unirse a megalina humana y que se une a un soporte sólido y un segundo ligando que puede unirse a megalina humana,

comprendiendo el método permitir que la muestra reaccione con dicho primer ligando, permitir que la muestra reaccione con dicho segundo ligando y medir el segundo ligando que se une a dicho soporte sólido mediante formación de un complejo con megalina humana en la muestra y dicho primer ligando.

Método de determinación de megalina humana

Campo técnico

La presente invención se refiere a un método para detectar nefropatía midiendo megalina humana. Más particularmente, la presente invención se refiere a un método para detectar megalina humana que comprende detectar cuantitativamente megalina que se expresa de manera tópica y específicamente en células, tejidos y órganos donde se observa expresión de megalina de manera rápida y sencilla, para de ese modo permitir el diagnóstico temprano y directo del grado en el que células, tejidos y órganos están afectados y mejorar y evitar el empeoramiento de las condiciones de trastornos y el pronóstico mediante tratamiento. La presente invención puede aplicarse a diagnóstico de nefropatía.

Técnica anterior

1. Clonación de megalina

Como resultado de una búsqueda de un antígeno etiológico de nefritis de Heymann, que es un modelo para nefropatía membranosa experimental, Kerjaschki, D. y Farquhar, M.G. identificaron una proteína de membrana celular, gp330, en 1982 (Kerjaschki D., Farquhar M.G., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 79, 5557-5561) . En 1994, Saito, A. et al. determinaron la estructura primaria completa de una gp330 de rata y la designaron como megalina, porque era la mayor proteína clonada de membrana celular de un vertebrado (Saito A. et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 91, 9725-9729) .

2. Sitio de expresión de megalina

La megalina también se conoce como glicoproteína 330 (gp330) o proteína 2 relacionada con el receptor de la lipoproteína de baja densidad (LDL) (LRP-2) . Es una glicoproteína que tiene un peso molecular de aproximadamente 600 kDa, que se expresa en células epiteliales del túbulo proximal de riñón, en otros tejidos y células, tales como células alveolares de tipo II, tejido espermático, endometrio uterino, placenta o epitelio del oído interno, epitelio renal, germo-vitelario y ectodermo neural (véase Christensen E. I., Willnow, T. E., 1999, J. Am. Soc. Nephrol. 10, 22242236; Juhlin C., Klareskog L. et al., 1990, J. Biol. Chem. 265, 8275-8279; y Zheng G, McCluskey R. T. et al., 1994, J. Histochem. Cytochem. 42, 531-542) . En el riñón, la megalina funciona como receptor de endocitosis asociado con endocitosis y reabsorción de proteínas y similares en el túbulo proximal antes de la excreción urinaria. Las proteínas reabsorbidas y similares se degradan entonces por lisosomas (véase Mausbach A. B., Christensen E. I., 1992, Handbook of Physiology: Renal Physiology, Windhager, editor, Nueva York, Oxford University Press, 42-207) .

3. Secuencia de nucleótidos de megalina

La megalina es una glicoproteína que es la que se expresa de manera más frecuente en la membrana epitelial del túbulo proximal de riñón de un animal mamífero. La secuencia codificante de ADNc de la misma tiene identidad de nucleótidos con la secuencia de ADNc de megalina humana que tiene el número de registro génico U04441 dado a conocer en Korenberg, J. R. et al. (1994) o la secuencia de ADNc de megalina humana que tiene el número de registro génico U33837 dado a conocer en Hjaeln, G., et al. (1996) (véase Korenberg J. R. et al., 1994, Genomics 22, 88-93; y Hjalm G. et al., 1996, Eur. J. Biochem. 239, 132-137) .

Además, se ha descubierto megalina de rata que tiene homología con megalina humana por Saito et al. (1994) y la secuencia de ADNc de la misma que tiene número de registro génico L34049 ya se ha dado a conocer (véase Saito A. et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 91, 9725-9729) .

4. Secuencia de aminoácidos y estructura proteica de megalina La megalina es una proteína gigante de membrana celular que consiste en 4.655 aminoácidos (en el caso de la megalina humana) y en 4.660 aminoácidos (en el caso de la megalina de rata) . El peso molecular deducido basándose en la secuencia de aminoácidos es aproximadamente 520 kDa y puede ser de hasta aproximadamente 600 kDa, cuando incluye una cadena de azúcar (véase Saito A. et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 91, 97259729) . La megalina pertenece a la familia génica del receptor de LDL, teniendo una región extracelular gigante de la misma cuatro dominios funcionales y estando conectada la región extracelular a una región intracelular delgada a través de una región transmembrana individual. La megalina está principalmente presente en un hueco recubierto de clatrina en el glomérulo (rata) o la membrana luminal epitelial (membrana basal y luminal en la célula epitelial glomerular) del túbulo proximal, célula alveolar de tipo II, glándulas epididimales, glándulas tiroideas, glándulas tiroideas accesorias, membrana del saco vitelino, oído interno, intestino delgado o corioides, y se está asociada con la captación de diversos ligandos en las células y el metabolismo de las mismas (véase Farquhar M. G. et al., 1995,

J. Am. Soc. Nephrol. 6, 35-47; y Christensen E. I. et al., 2002, Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 3, 256-266) . Proteinuria de bajo peso molecular, trastornos del metabolismo óseo, insuficiencia respiratoria, malformación del cerebro, y otros trastornos se producen en ratones deficientes en megalina (véase Willnow T. E. et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 93, 8460-8464) . Un homólogo de megalina está también presente en nematodos (C. elegans) y se ha sugerido la importancia biológica de la misma (véase Yochem J. et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 90, 45724576) .

Norden et al., 2002, describen la deficiencia en megalina urinaria en pacientes con enfermedad de Dent y síndrome de Lowe pero no síndrome de Fanconi idiopático dominante autosómico. Se analizaron muestras urinarias mediante electroforesis en gel/inmunotransferencia.

5. Importancia de megalina como causa de nefritis La megalina, que es un antígeno etiológico principal de nefropatía membranosa experimental (nefritis de Heymann) , es un receptor eliminador epitelial y se han dilucidado papeles patológicos y biológicos de la misma. Se han usado modelos animales durante mucho tiempo para dilucidar el mecanismo de desarrollo de la nefropatía membranosa humana y la nefritis de Heymann en ratas es un modelo de nefropatía membranosa. El análisis de la nefritis de Heymann ha sido más avanzado que el de cualquier otro modelo. Saito A. et al. dieron a conocer los resultados del análisis del epítopo patológico y el dominio de unión a ligando de la nefritis de Heymann y también han demostrado la región antigénica principal de megalina y un dominio funcional de megalina que contribuye principalmente a la unión a un ligando (véase Kerjaschki D. et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 89, 11179-11183; Saito A., Farquhar M. G. et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 93, 8601-8605; Yamazaki H., Farquhar M. G. et al., 1998,

J. Am. Soc. Nephrol. 9, 1638-1644; y Orlando R. A., Farquhar M. G. et al., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 94, 2368-2373) .

6. Diversos ligandos de megalina La megalina se expresa de manera más abundante en el lado luminal de las células epiteliales del túbulo proximal in vivo. En el riñón humano, no se observa expresión de megalina en sitios distintos de las células epiteliales del túbulo proximal, incluyendo en los glomérulos. La megalina incorpora diversos ligandos (por ejemplo, fármacos o una proteína de bajo peso molecular) que se filtran por los glomérulos al interior de células mediante endocitosis, la megalina los transporta a lisosomas y reaparecen en la superficie celular mediante recirculación (véase Farquhar M.

G. et al., 1995, J. Am. Soc. Nephrol. 6, 35-47; y Christensen E. I. et al., 2002, Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 3, 256-266) . Además, la megalina está asociada con transcitosis desde el lado luminal hasta el lado de membrana basal. La megalina también está asociada con la captación y el metabolismo de proteínas de unión, tales como vitaminas A, B12 y D (véase Christensen E. I. et al., 2002, Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 3, 256-266) . Christensen y Willnow demostraron que la megalina media la reabsorción de tres proteínas portadoras de vitaminas, proteínas de unión a vitamina D (DBP) , proteína de unión a retinol (RBP) y transcobalamina (TC) y vitaminas asociadas con las mismas; es decir, vitamina 25D3 (OH) , vitamina A (retinol) y vitamina B12 (véase Christensen E. I., Willnow T. E., 1999, J. Am. Soc. Nephrol. 10, 2224-2236) . Saito A. et al. demostraron que la leptina, que se secreta a partir de adipocitos y aumenta en la sangre de pacientes obesos, se incorpora en y se metaboliza por las células epiteliales del túbulo proximal como el ligando de megalina (véase Saito A., Gejyo F. et al., 2004, Endocrinology. 145, 3935-3940) . Los adipocitos, es decir, grasas viscerales acumuladas, dan como resultado estados patológicos... [Seguir leyendo]

1. Método para detectar nefropatía mediante la determinación de una cantidad aumentada de megalina humana en una muestra de orina usando un primer ligando que puede unirse a megalina humana y que se une a un soporte sólido y un segundo ligando que puede unirse a megalina humana, comprendiendo el método permitir que la muestra reaccione con dicho primer ligando, permitir que la muestra reaccione con dicho segundo ligando y medir el segundo ligando que se une a dicho soporte sólido mediante formación de un complejo con megalina humana en la muestra y dicho primer ligando.

2. Método para detectar nefropatía según la reivindicación 1, en el que el primer ligando que puede unirse a megalina humana y el segundo ligando que puede unirse a megalina humana son ambos anticuerpos.

3. Método según la reivindicación 2, en el que los anticuerpos son anticuerpos monoclonales anti-megalina humana. 15

4. Método para detectar nefropatía mediante la determinación de una cantidad aumentada de megalina humana en una muestra de orina usando megalina humana o un fragmento parcial de megalina humana que se une a un soporte sólido y un ligando que puede unirse a megalina humana, comprendiendo el método permitir que la muestra reaccione con dicho ligando, permitir que el producto reaccione con la megalina humana que se une a un soporte sólido, medir el ligando que puede unirse a megalina humana que se une a un soporte sólido y cuantificar la megalina humana en la muestra basándose en una disminución en un porcentaje del ligando que puede unirse a megalina humana que se une a un soporte sólido.

5. Método para detectar nefropatía según la reivindicación 4, en el que el ligando que puede unirse a megalina humana es un anticuerpo monoclonal anti-megalina humana.

6. Uso de megalina humana como marcador de detección de enfermedad para detectar nefropatía en el

método según la reivindicación 1. 30