Método de amplificación directa a partir de muestras de ácido nucleico en bruto.

Un método que comprende:

proporcionar sangre sobre papel o un frotis bucal sobre papel,

en donde el papel contiene un reactivo de lisis;

colocar la sangre sobre papel o el frotis bucal sobre papel en un tampón directo para formar una solución que contiene ácido nucleico; y

realizar una PCR en la solución que contiene ácido nucleico, en donde el tampón directo comprende el 0,2 % - 0,9 % de polisorbato, el 3 % - 8 % de glicerol y 1000 - 3000 ug/ml de BSA.

Método de amplificación directa a partir de muestras de ácido nucleico en bruto Referencia a solicitudes relacionadas

La presente solicitud reivindica beneficio de prioridad conforme a 35 U.S. C. § 119(e) sobre la solicitud de EE.UU. N2 61/77/113 presentada el 3 de junio de 28.

Campo

Las presentes enseñanzas generalmente se refieren a métodos para amplificar directamente ácidos nucleicos a partir de muestras en bruto.

Introducción

Una detección rápida y precisa de perfiles de ADN es un aspecto clave del análisis de muestras de casos forenses. Las muestras en bruto, tales como la sangre y los frotis bucales, contiene sustancias que pueden inhibir la actividad de las polimerasas usadas para el tipado de repeticiones cortas en tándem basado en PCR. Históricamente ha sido necesario retirar los inhibidores y purificar el ADN antes de realizar manipulaciones enzimáticas aguas abajo, tales como amplificación por PCR. Comercialmente se dispone de muchos tipos de métodos de aislamiento y purificación de ADN y kits. El documento WO /5564 A2 se refiere a una composición y a un método para extraer el ADN. El documento WO 28/274 A2 proporciona métodos y composiciones para extraer ARN de las células. El documento WO 26/9987 A1 describe métodos para realizar una reacción enzimática directa que implica una molécula de ácido nucleico y usa un tampón zwiteriónico y/o un carbohidrato no reductor para impedir que la muestra biológica inhiba la reacción enzimática. El documento EP 1 5 587 B1 describe composiciones y métodos para la generación de ácidos nucleicos a partir de un molde de ácido ribonucleico y adicionalmente la replicación de ácido nucleico. No obstante, su uso añade tiempo y gastos a la preparación de muestras para el posterior análisis.

Sumario

La invención se puede definir mediante las reivindicaciones adjuntas. De acuerdo con un primer aspecto, la invención proporciona un método de acuerdo con las reivindicaciones 1 - 5, 7 y 9. De acuerdo con un segundo aspecto, la invención proporciona una mezcla de reacción de acuerdo con las reivindicaciones 6 y 8. Las presentes enseñanzas proporcionan un método de realizar una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) que comprende proporcionar una muestra en bruto, que comprende: ácido desoxirribonucleico; opcionalmente incubar la muestra en bruto con NaOH a de 5 mM de 25 mM; mezclar la muestra en bruto con un tampón directo para formar una solución que contiene ácido nucleico y realizar una PCR con el ácido desoxirribonucleico, en el que el tampón directo comprende al menos un 3 % - 8 % de glicerol, ,2 % - ,9 % de tensioactivos no iónicos y 1 - 3 ug/ml de BSA. Los tensioactivos no iónicos adecuados incluyen, entre otros, polisorbato (Tween), Tween 2, Triton-X 1 y similares.

Las presentes enseñanzas proporcionan métodos para realizar una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) que comprende proporcionar una muestra en bruto que comprende: ácido desoxirribonucleico; incubar opcionalmente la muestra en bruto con NaOH a de 5 mM a 25 mM; mezclar la muestra en bruto con un tampón directo para formar una solución que contiene ácido nucleico y realizar la PCR con la solución, en el que el tampón directo comprende al menos 5 pares de cebadores para PCR, Tris-HCI 1 - 5 mM (pH 8,3), KCI 3 - 8 mM, MgCÍ21,4 - 2,4 mM, ,1 % - ,4 % de azida sódica, 3 % - 8 % de glicerol, 1 - 35 uM de cada dNTP, ,2 % - ,9 % de polisorbato, 1 - 3 ug/ml de BSA y ,1 - ,35 U/ul de ADN polimerasa.

En algunas realizaciones, las presentes enseñanzas proporcionan métodos de determinación de la identidad de un ser humano, que comprende proporcionar una muestra en bruto que comprende ácido desoxirribonucleico del ser humano; incubar opcionalmente la muestra en bruto con NaOH de 5 mM a 25 mM; mezclar la muestra en bruto con el tampón directo que forma una solución que contienen ácido nucleico, en los que el tampón directo comprende una pluralidad de pares de cebadores; en los que cada par de cebador flanquea a un locus genómico que contiene una repetición corta en tándem (STR); realizar una PCR con la solución para formar una pluralidad de amplicones de PCR; en los que cada amplicón de PCR tiene un tamaño determinable; e identificar el ser humano con referencia al tamaño de los amplicones de PCR; en los que eL tampón directo comprende adicionalmente Tris - HCI 1-5 mM (pH 8,3), KCI 3 - 8 mM, MgCb 1,4 - 2,4 mM, ,1 % - ,4 % de azida sódica, 3 % - 8 % de glicerol, 1 - 35 uM de cada dNTP, ,2 % - ,9 % de polisorbato, 1 - 3 ug/ml de BSA; y ,11 - ,35 U/ul de ADN polimerasa.

En algunas de las realizaciones se incluyen métodos de preparar ácidos nucleicos para una manipulación enzimática aguas abajo que comprenden proporcionar una muestra en bruto, que comprende: ácido desoxirribonucleico; incubar opcionalmente la muestra en bruto con NaOH a de 5 mM a 25 mM; mezclar la muestra en bruto con un tampón directo para formar una solución que contiene ácido nucleico y realizar una manipulación enzimática aguas abajo en la solución, en el que el tampón directo comprende Tris-HCI 1-5 mM (pH 8,3), KCI 3

- 8 mM, MgCI21,4 - 2,4 mM, ,1 % - ,4 % de azida sódica, 3 % - 8 % de glicerol, 1 - 35 uM de cada dNTP, ,2 % - ,9 % de polisorbato, 1 - 3 ug/ml de BSA y ,1 - ,35 U/ul de ADN polimerasa. En algunas realizaciones, la manipulación enzimática aguas abajo es PCR.

Las presentes enseñanzas también proporcionan kits para análisis genético, comprendiendo los kits una pluralidad de pares de cebadores, en los que cada par de cebadores flanquea un locus genómico que contiene una repetición corta en tándem (STR), y un tampón directo, en el que el tampón directo comprende Tris-HCI 1-5 mM (pH 8,3), KCI 3 - 8 mM, MgCI21,4 - 2,4 mM, ,1 % - ,4 % de azida sódica, 3 % - 8 % de glicerol, 1 - 35 uM de cada dNTP, ,2 % - ,9 % de polisorbato, 1 - 3 ug/ml de BSA y ,1 - ,35 U/ul de ADN polimerasa. En algunas realizaciones, los kits como se han expuesto anteriormente pueden incluir opcionalmente NaOH u otros compuestos alcalinos fuertes u otros agentes para lisis celular.

Otras realizaciones son mezclas de reacción que comprenden un tampón directo y una pluralidad de pares de cebadores, en los que cada par de cebadores flanquea un locus genómico que contiene una repetición corta en tándem (STR), y en los que el tampón directo comprende Tris-HCI 1-5 mM (pH 8,3), KCI 3 - 8 mM, MgCI21,4 - 2,4 mM, ,1 % - ,4 % de azida sódica, 3 % - 8 % de glicerol, 1 - 35 uM de cada dNTP, ,2 % - ,9 % de polisorbato, 12 - 3 ug/ml de BSA y ,1 - ,35 U/ul de ADN polimerasa. En algunas realizaciones, los kits como se han expuesto anteriormente pueden incluir opcionalmente NaOH u otros compuestos alcalinos fuertes u otros agentes para lisis celular.

Breve descripción de las figuras

El experto en la técnica entenderá que las figuras, que se describen más adelante, son con fines ilustrativos únicamente.

La Figura 1 es un electroferograma de un perfil de STR de ADN gnómico de una muestra de sangre.

Las Figuras 2A-2D son electroferogramas de perfiles de STR fallados de muestras de sangre que se han transferido a papel de FTA.

Las Figuras 3A a 12B son electroferogramas comparativos de perfiles de STR de 1 individuos cuya sangre se transfirió a papel FTA, una perforación de la cual se introdujo en tampón directo de las presentes enseñanzas en el presente documento y de ha denominado "A". Al tiempo que los electroferogramas designados "B" representan perfiles de STR de la sangre de los mismos 1 individuos preparada usando el sistema de purificación PowerPlex 16 HS comercializado por Promega.

Descripción de las realizaciones de ejemplo

En la presente solicitud, el uso del singular incluye el plural a menos que específicamente se indique lo contrario. En esta solicitud, la palabra "un" o "uno/a" significa "al menos uno/a" a menos que se indique específicamente lo contrario. En esta solicitud, el uso de "o" significa "y/o", a menos que se indique lo contrario. Además, el uso del término "que incluye", así como otras formas, tales como "incluye" e "incluido" no es limitante.

Los títulos de las secciones usadas en el presente documento son sólo para propósitos de organización y no deben interpretarse como una limitación del objeto descrito.

Algunas definiciones

Como se usa en el presente documento, la expresión "muestra en bruto" hace referencia a una muestra de origen biológico que se sospecha que contiene ácidos nucleicos, que no ha sufrido procedimientos para aislamiento o purificación de dichos ácidos nucleicos. Por ejemplo, una muestra de sangre es una muestra en bruto. Las células en la muestra en bruto pueden opcionalmente lisarse. Adicionalmente, una muestra de sangre transferida a papel... [Seguir leyendo]

1. Un método que comprende:

proporcionar sangre sobre papel o un frotis bucal sobre papel, en donde el papel contiene un reactivo de lisis; colocar la sangre sobre papel o el frotis bucal sobre papel en un tampón directo para formar una solución que contiene ácido nucleico; y

realizar una PCR en la solución que contiene ácido nucleico, en donde el tampón directo comprende el ,2 % - ,9 % de polisorbato, el 3 % - 8 % de glicerol y 1 - 3 ug/ml de BSA.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el tampón directo comprende además Tris-HCI 1-5 mM (pH 8,3), KCI 3 - 8 mM, MgCI21,4 - 2,4 mM, ,1 % - ,4 % de azida sódica, 1 - 35 uM de cada dNTP y ,1 - ,35 U/ul de ADN polimerasa.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el polisorbato es polisorbato 2.

4. El método de la reivindicación 1, en el que el tampón directo comprende adicionalmente una pluralidad de pares de cebadores.

5. El método de la reivindicación 4, en el que se proporciona sangre humana o un frotis bucal humano, en el que cada par de cebadores flanquea un locus genómico que contiene una repetición corta en tándem,

en el que la PCR se realiza con la solución que contiene ácido nucleico para formar una pluralidad de amplicones de PCR, en donde cada amplicón de PCR tiene un tamaño determinable; y el método comprende además identificar el ser humano con referencia al tamaño de los amplicones de PCR.

6. Una mezcla de reacción que comprende un tampón directo, sangre sobre papel o un frotis bucal sobre papel y una pluralidad de pares de cebadores, en donde el papel contiene un reactivo de lisis y en donde el tampón directo comprende Tris-HCI 1 - 5 mM (pH 8,3), KCI 3 - 8 mM, MgCI21,4 - 2,4 mM, ,1 % - ,4 %de azida sódica, 3% - 8 % de glicerol, 1 - 35 uM de cada dNTP, ,2 % - ,9 % de polisorbato 2, 1.2 - 3. ug/ml de BSA y ,1 - ,35 U/ul de ADN polimerasa.

7. El método de la reivindicación 1, en el que el papel es papel FTA.

8. La mezcla de la reivindicación 6, en donde el papel es papel FTA.

9. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que proporcionar sangre sobre papel o un frotis bucal sobre papel comprende proporcionar un papel de FTA y transferir sangre o recolectar células bucales sobre el papel.