Mejoras relativas a la descelularización de matrices de tejido para el implante de vejiga.

Un método de descelularización de un tejido que comprende un saco membranoso distensible,

el método comprende:

(i) sumergir el saco membranoso distensible en una solución tampón a un pH alcalino suave que incluye cantidades activas de un inhibidor proteolítico;

(ii) distender el saco membranoso distensible mediante la introducción de un volumen suficiente de la misma solución tampón en la cavidad interior del saco y;

(iii) continuar la descelularización del saco mediante la sustitución y la introducción de soluciones frescas tanto alrededor de la superficie exterior del saco y en el propio saco interior a fin de mantener la distensión del saco durante descelularización.

Mejoras relativas a la descelularización de matrices de tejido para el implante de vejiga La presente invención se refiere a un método de producción de un soporte de matriz acelular natural para su uso posterior en la sustitución de tejidos mediante la ingeniería de tejido. La invención proporciona un biomaterial que es conveniente para el reemplazo y/o la reparación de tejidos en particular, aunque no exclusivamente, en los campos de la gastroenterología, la urología, la cirugía estética, la reparación de heridas y la cirugía reconstructiva. La invención proporciona además el uso de los soportes de matriz para investigar la estructura y la función tisular in vitro.

Antecedentes En la actualidad, los biomateriales naturales se utilizan principalmente en la cirugía reconstructiva, principalmente en los campos de la gastroenterología, la urología y la cicatrización de las heridas, pero con un aumento de las aplicaciones en la cirugía cardiovascular y la cosmética. Uno de tales biomateriales, la submucosa del intestino delgado porcino (SIS) , se usa en la gastroenterología, en la urología y en aplicaciones de la curación de heridas, ya que se incorporan fácilmente en el tejido huésped y remodelado. Sin embargo, trabajos recientes para investigar la adherencia y la viabilidad de células humanas sembradas sobre la SIS demostró que las muestras de SIS disponibles comercialmente contenían residuos nucleares porcinos y eran citotóxicas in vitro. Adicionalmente, el uso clínico de la SIS dio lugar a una inflamación localizada, lo que sugiere que el material puede causar una respuesta inmunológica in vivo. Un biomaterial alternativo natural es la dermis porcina descelularizada (Permacol™) , que tiene una amplia variedad de usos en procedimientos médicos y cosméticos y se implantó en más de 8500 pacientes en más de 70 procedimientos quirúrgicos diferentes desde que se autorizó para el uso en seres humanos en 1998. Sin embargo, Permacol™ tiene una desventaja asociada con este material es que no sólo es parcialmente reabsorbible, sino que cuando se utiliza en un modelo animal de aumento de la vejiga se demostró que causa micro-calcificación y la regeneración del detrusor irregular. Además, Permacol™ es incapaz de soportar la recelularización in vitro y evita así su uso como un biomaterial que pudiera sembrarse con las células y funcionalizarse antes del implante. Un biomaterial natural mejorado que sea inmunológicamente inerte y capaz de soportar la recelularización ofrecería una ventaja inmediata en la técnica.

Se estima que más de 400 millones de personas en todo el mundo sufren de algún tipo de disfunción de la vejiga. Una variedad de diversas afecciones congénitas y adquiridas resultan de la disfunción de la vejiga, por ejemplo cáncer, anomalías congénitas, daño nervioso o trauma. Actualmente, la solución quirúrgica principal es la reconstrucción quirúrgica. Se conoce en la técnica anterior para reparar o aumentar o sustituir la vejiga durante estos procedimientos con segmentos vascularizados del propio tejido del paciente derivados de su estómago o más comúnmente el intestino. Sin embargo, este último procedimiento ('enterocistoplastia') se asocia con complicaciones clínicas significativas que surgen debido a la exposición del revestimiento epitelial del intestino a la orina. Se encontró que el uso del intestino da como resultado complicaciones significativas, tales como la infección y el desarrollo de cálculos en la vejiga, ya que el intestino se reviste por un epitelio secretor de moco y absorbente que es incompatible con la exposición a largo plazo a la orina. En consecuencia, se propusieron una serie de enfoques alternativos para encontrar un sustituto práctico y funcional para el tejido natural de la vejiga. Una de las soluciones alternativas es la 'enterocistoplastia compuesta', donde la pared del intestino sin epitelio se recubre con células epiteliales de la vejiga que se propagaron in vitro, para aumentar el sistema urinario con biomateriales naturales o sintéticos que pueden incorporar células propagadas in vitro. Sin embargo, incluso esta forma modificada de enterocistoplastia se asocia con efectos secundarios adversos. La falta de un procedimiento clínico totalmente satisfactorio llevó a los investigadores a investigar estrategias alternativas.

Se realizaron intentos para desarrollar biomateriales adecuados para la ingeniería de tejidos urológicos utilizando materiales sintéticos, por ejemplo, ácido poliglicólico y ácido poli-L-láctico, y materiales derivados naturalmente que incluyen la SIS, el Permacol™ y la matriz de vejiga porcina. Sin embargo, se encontró que ninguno de estos materiales es totalmente exitoso frente a la inmunogenicidad y el rechazo y la recelularización.

Las matrices de tejido antes de la implantación se someten a un proceso de descelularización a fin de reducir su inmunogenicidad una vez que se implantan. Este proceso implica eliminar las células del donante, mientras que idealmente se conserva la estructura y la función biomecánica de la matriz. En cuanto a la vejiga, es especialmente deseable mantener las propiedades mecánicas normales y su elasticidad. Se conoce de US 2004/234507 perforar o puncionar los injertos submucosos sin embargo esto compromete la histoarquitectura. WO 02/ 096476 describe un método que no da lugar a la descelularización.

Un problema que se asocia con el uso de una matriz de la vejiga es que el tejido de la vejiga es relativamente grueso (1-5 mm cuando no se distiende) . Esto a su vez significa que es difícil descelularizar el tejido de la vejiga para proporcionar una matriz de soporte inmunológicamente inerte usando métodos de rutina que se conocen en la técnica. Los intentos de

descelularizar segmentos que se disectan de la vejiga porcina de grosor completo se tradujeron en una descelularización incompleta. El análisis histológico de estas muestras indica que las células no se eliminaron de la pared muscular de la vejiga. En su forma recuperada, la vejiga porcina era demasiado gruesa para permitir la penetración eficaz de las disoluciones que se utilizan en todo el proceso de descelularización. Con el fin de superar este problema los segmentos de tejido de la vejiga de espesor reducido podrían utilizarse para permitir la descelularización exitosa.

Un método mejorado de descelularización que podría utilizarse para descelularizar vejigas enteras u otros sacos membranosos de espesor completo, y conservar las propiedades biomecánicas del tejido, ofrecería una ventaja inmediata en el campo de particularmente pero no exclusivamente, la ingeniería de tejidos urológicos.

Breve resumen de la descripción De conformidad con un primer aspecto de la invención se proporciona un método de descelularización de un tejido que comprende un saco membranoso distensible, el método comprende:

(i) sumergir el saco membranoso distensible en una disolución tampón a un pH alcalino suave que incluye cantidades activas de un inhibidor proteolítico;

(ii) distender el saco membranoso distensible mediante la introducción de un volumen suficiente de la misma disolución tampón en la cavidad interior del saco y;

(iii) continuar la descelularización del saco mediante la sustitución y la introducción de disoluciones frescas tanto alrededor de la superficie exterior del saco como en el propio saco interior a fin de mantener la distensión del saco durante descelularización.

Se apreciará que la etapa (ii) puede llevarse a cabo antes de la etapa (i) y que la esencia de estas dos etapas es asegurar que tanto el interior como el exterior del saco membranoso distensible estén en contacto con el tampón para que una descelularización eficaz tenga lugar. Si el saco se llena con el fluido del tampón y después se sumerge en el tampón o si se sumerge en el tampón y luego se llena con el tampón no es significativo para el método siempre que el saco esté en contacto con el tampón en sus dos superficies membranosas interior y exterior y que permanezca en una forma distendida mientras se produce la descelularización.

La referencia en la presente invención a un saco membranoso distensible se pretende que incluya un tejido o saco o globo de tejido que tenga una membrana elástica o flexible. Es decir, cuando el tejido in vivo tiene la capacidad de expandirse y para volver a un estado normal de reposo sin ruptura o alteración de sus propiedades mecánicas.

La referencia en la presente invención a la descelularización se pretende que incluya la eliminación de las membranas celulares, los ácidos nucleicos, los lípidos, los componentes citosólicos y la retención de un ECM que tenga como componentes principales colágenos y elastinas.... [Seguir leyendo]

1. Un método de descelularización de un tejido que comprende un saco membranoso distensible, el método comprende:

(i) sumergir el saco membranoso distensible en una solución tampón a un pH alcalino suave que incluye cantidades activas de un inhibidor proteolítico;

(ii) distender el saco membranoso distensible mediante la introducción de un volumen suficiente de la misma solución tampón en la cavidad interior del saco y;

(iii) continuar la descelularización del saco mediante la sustitución y la introducción de soluciones frescas tanto alrededor de la superficie exterior del saco y en el propio saco interior a fin de mantener la distensión del saco durante descelularización.

2. El método de la reivindicación 1 en donde la etapa (ii) se realiza antes de la etapa (i) .

3. El método de la reivindicación 1 o 2 en donde el saco membranoso distensible se sujeta antes y después de cada etapa de reposición de fluidos para evitar la pérdida de fluido y para mantener la distensión del saco.

4. El método de cualquier reivindicación precedente en donde el volumen de fluido que se añade a la cavidad interior

del saco en cada etapa está entr.

25. 750 ml y en donde el volumen de fluido alrededor del exterior del saco es suficiente para cubrir o sumergir la totalidad del saco distendido lleno de fluido.

5. El método de cualquier reivindicación precedente en donde una vez que el proceso de descelularización se completa el saco distensible se disecta ya sea para formar una lámina aplanada o para permanecer intacto.

6. El método de cualquier reivindicación precedente en donde el saco membranoso distensible es una vejiga completa, y opcionalmente en donde la vejiga se deriva de un cerdo o de un ser humano.

7. El método de cualquier reivindicación precedente en donde la etapa de continuar la descelularización comprende:

(i) retirar dicho tampón a un pH alcalino suave que incluye cantidades activas del inhibidor proteolítico de la cavidad interior del saco y de la zona exterior que lo rodea y sustituirlo por un detergente aniónico a un pH alcalino suave a una concentración que es suficiente para efectuar la descelularización pero que mantiene la histoarquitectura del material biológico;

(ii) retirar dicho detergente del interior del saco y de su exterior y sustituirlo por una disolución tampón de lavado a un pH alcalino suave con y sin cantidades activas de los inhibidores proteolíticos para lavar las superficies interiores y exteriores del saco membranoso distensible;

(iii) retirar dicho tampón de lavado, tanto del interior del saco como de su exterior y sustituirlo por una disolución que comprende una o más enzimas seleccionadas del grupo que comprende DNasa tipo I, ADNasa 40 tipo II, y/o RNasa y opcionalmente;

(iv) eliminar la disolución que comprende una o más enzimas del interior del saco y su exterior y colocar opcionalmente el material biológico en un medio de almacenamiento o medio crioprotector u otro medio de protección adecuado para su uso posterior.

8. El método de conformidad con cualquier reivindicación precedente, que incluye además la etapa de modificar la matriz tisular del saco descelularizada con un agente químico o enzimático para mejorar la inmunoaceptabilidad de la matriz, opcionalmente en donde el agente químico es un agente de reticulación y, opcionalmente, en donde el agente enzimático es una α-galactosidasa o una digestión de glucosidasa para eliminar epítopos α-gal (Gal α1-3 Gal β1-4Glc NAC-R) .

9. El método de cualquier reivindicación precedente, que incluye además la etapa de recelularización, opcionalmente en donde la etapa de recelularización se refuerza por la adición de un agente adecuado administrado in vitro o recubierto directamente sobre la matriz tisular antes de la implantación para fomentar la recelularización.

10. Una matriz tisular de la vejiga descelularizada biocompatible obtenible por el método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 caracterizada por un contenido de ADN de menos de 0.2 μg/mg de peso seco, una resistencia de retención de sutura (Fmax) de entre 3-6 N, una resistencia a la tracción última (del ápice a la base) de entre 1-4 MPa, una resistencia al fallo (del ápice a la base) de entr.

7. 150 %, determinada por los métodos que se definen en la descripción.

11. Una matriz tisular de la vejiga descelularizada de conformidad con la reivindicación 10 que carece del urotelio y no tiene células presentes en el tejido subyacente.

12. Una matriz tisular de la vejiga descelularizada de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10 u 11 que 5 tiene una presión de estallido similar a la del tejido de la vejiga fresco.

13. Una matriz tisular de vejiga descelularizada obtenible por el método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y que tiene las características que se exponen en cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12 para usar en una cualquiera o más de las funciones seleccionadas del grupo que comprende

(i) tejido de transplante;

(ii) material de implante

(iii) reconstrucción de defectos de la vejiga congénitos o adquiridos;

(iv) reparación del tejido; 15 (v) cicatrización de heridas o reparación de heridas;

(vi) cirugía cosmética como material de aumento;

(vii) un soporte para la ingeniería de tejido; y

(viii) como un modelo in vitro para investigar la función de la vejiga.

14. Un producto que comprende la vejiga completa descelularizada que obtenible por el método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 caracterizado porque el producto tiene un contenido de ADN de menos de 0.2 μg/mg de peso seco, una resistencia de retención de sutura (Fmax) de entre 3-6 N, una resistencia a la tracción última (del ápice a la base) de entre 1-4 MPa, una resistencia al fallo (del ápice a la base) de entr.

7. 150 %, que se determinan por métodos como se define en la descripción.