Loci de inmunoglobulina humanizada.

Un vector transgénico que comprende un locus de Ig humanizada,

donde dicho locus de Ig humanizada procede de un locus de Ig o de una porción de un locus de Ig de un conejo, que comprende múltiples segmentos génicos de Ig, donde:

(a) dichos segmentos génicos son de la SEC ID Nº: 189, 190, 191 y 192;

(b) dichos segmentos génicos están yuxtapuestos en una configuración no reordenada, parcialmente reordenada o totalmente reordenada, y

(c) dicho locus de Ig humanizada es capaz de someterse a reordenamiento génico, si es necesario, y conversión génica y/o hipermutación, y de producir un repertorio de inmunoglobulinas humanizadas en dicho conejo.

Loci de inmunoglobulina humanizada Campo de la invenciïn La presente invenciïn se refiere a mïtodos y a medios para producir anticuerpos humanizados a partir de animales transgïnicos no humanos. La invenciïn se refiere en concreto a nuevas construcciones de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina, a vectores de recombinaciïn y transgïnicos ïtiles para producir animales transgïnicos no humanos que expresen anticuerpos humanizados, y a animales transgïnicos. Los vectores transgïnicos contienen loci de inmunoglobulina humanizada que son capaces de someterse a reordenamiento gïnico, a conversiïn gïnica y a hipermutaciïn en animales transgïnicos no humanos para producir anticuerpos humanizados diversificados, mientras se deja la maquinaria reguladora endïgena y de producciïn de anticuerpos del animal no humano sustancialmente intacta. Los anticuerpos humanizados obtenidos tienen una inmunogenicidad mïnima en los seres humanos y son apropiados para usarse en el tratamiento terapïutico de sujetos humanos.

Antecedentes de la invenciïn Los anticuerpos son una clase importante de productos farmacïuticos que se han usado con ïxito en el tratamiento de varias enfermedades y afecciones humanas, tales como cïnceres, enfermedades alïrgicas, prevenciïn del rechazo a trasplantes y la enfermedad injerto contra huïsped.

Un problema importante asociado con las preparaciones de anticuerpos obtenidas a partir de animales es la inmunogenicidad intrïnseca de las inmunoglobulinas no humanas en pacientes humanos. Para reducir la inmunogenicidad de anticuerpos no humanos, se ha demostrado que mediante la fusiïn de exones de regiïn variable (V) de animal con exones de regiïn constante (C) humana, se puede obtener un gen de anticuerpo quimïrico.

Tambiïn se han desarrollado anticuerpos monoclonales humanizados y estïn en uso clïnico. Los anticuerpos monoclonales humanizados son tïpicamente anticuerpos humanos en los cuales se sustituyen algunos restos de CDR y posiblemente algunos restos de FR por restos de sitios anïlogos en anticuerpos de animales no humanos, por ejemplo roedores. La humanizaciïn puede realizarse sustancialmente siguiendo el mïtodo de Winter y colaboradores (Jones et al., Nature, 321: 522 (1986) ; Riechmann et al., Nature, 332: 323 (1988) ; Verhoeyen et al., Science, 239: 1534 (1988) ) , sustituyendo CDR o secuencias de CDR de animales no humanos, por ejemplo roedores, por las secuencias correspondientes de un anticuerpo monoclonal humano.

Se ha descrito que la eliminaciïn homocigïtica del gen de la regiïn de uniïn de cadena pesada (JH) de un anticuerpo en ratones quimïricos y en ratones con mutaciones en la lïnea germinal, da como resultado la inhibiciïn completa de la producciïn de anticuerpos endïgenos. La transferencia del conjunto de genes de inmunoglobulina de la lïnea germinal humana en este tipo de ratones mutantes de lïnea germinal ocasionarï la producciïn de anticuerpos humanos tras la exposiciïn a antïgenos. Vïase, por ejemplo, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci Estados Unidos 90: 2551 (1993) ; Jakobovitset al., Nature, 362: 255 (1993) ; Bruggemann et al., Year in Immunol., 7: 33 (1993) . Aunque este enfoque de ingenierïa genïtica daba como resultado la expresiïn de polipïptidos de inmunoglobulina humana en ratones genïticamente modificados, el nivel de expresiïn de inmunoglobulina humana 45 fue bajo. Esto puede ser debido a elementos reguladores especïficos de especie en los loci de inmunoglobulina que son necesarios para la expresiïn eficaz de inmunoglobulinas. Como se ha demostrado en lïneas celulares transfectadas, los elementos reguladores que estïn presentes en los genes de inmunoglobulina humana pueden dejar de funcionar debidamente en animales no humanos.

De hecho, se han descrito varios elementos reguladores en los genes de inmunoglobulina. Son de especial importancia los potenciadores cadena abajo (3') de regiones constantes de cadena pesada y los potenciadores intrïnicos en los genes de cadenas ligeras. Ademïs, hay otros elementos de control, aun por identificar, que pueden estar presentes en los genes de inmunoglobulina. Ciertos estudios en ratones han demostrado que la cola de membrana y la cola citoplïsmica de la forma de membrana de las molïculas de inmunoglobulina juegan un papel

importante en los niveles de expresiïn de los anticuerpos quimïricos de ratïn-humano en el suero de ratones homocigïticos para el gen Cy1 humano. Por esta razïn, para la expresiïn de genes de inmunoglobulina heterïlogos en animales es deseable reemplazar secuencias que contienen elementos potenciadores y exones que codifican la cola transmembrana (exïn M1) y la cola citoplïsmica (exïn M2) con secuencias que se encuentran normalmente en el animal en posiciones similares.

Ademïs de las cuestiones planteadas por la inmunogenicidad potencial de los anticuerpos no humanos, el uso de anticuerpos monoclonales en general, ya sean quimïricos, humanizados o humanos, estï limitado adicionalmente por el hecho de que enfermedades devastadoras tales como el cïncer e infecciones con patïgenos virulentos, son difïciles de tratar atacando una sola diana debido a su complejidad, etiologïa multifactorial y adaptabilidad. Los 65 anticuerpos monoclonales que se dirigen contra dianas singularmente definidas fallan cuando esas dianas cambian, evolucionan y mutan. Por esta razïn, las malignidades pueden ganar resistencia a las terapias de anticuerpos monoclonales estïndar. Una soluciïn para este problema es el uso de anticuerpos policlonales, que tienen la capacidad de dirigirse y atacar a una pluralidad de dianas en evoluciïn asociadas con enfermedades complejas. Los anticuerpos policlonales tambiïn tienen la capacidad de neutralizar toxinas bacterianas y virales, y dirigir respuestas inmunes directas para destruir y eliminar patïgenos.

Por consiguiente, hay una gran necesidad clïnica de un nuevo enfoque adecuado para la producciïn a gran escala de anticuerpos policlonales y monoclonales humanizados de alto tïtulo y alta afinidad.

La introducciïn de genes de inmunoglobulina humana en el genoma de los ratones tuvo como resultado la expresiïn de un repertorio de anticuerpos humanos diversificados en ratones genïticamente modificados. Tanto en ratones como en seres humanos, la diversidad de anticuerpos primarios se genera mediante reordenaciïn gïnica. Este proceso da como resultado la generaciïn de muchos segmentos V (D) J recombinados diferentes que codifican un gran nïmero de molïculas de anticuerpo con diferentes sitios de uniïn a antïgenos. Sin embargo, en otros animales como los conejos, los cerdos, las vacas y las aves, la diversidad de anticuerpos primarios se genera mediante mecanismos sustancialmente diferentes, particularmente mutaciones de la cadena molde o conversiïn gïnica y mutaciones fuera de la cadena molde o hipermutaciïn. Por ejemplo, estï bien establecido que en conejos y en pollos, la reordenaciïn de VDJ estï muy limitada (se genera casi un 90 % de inmunoglobulina con el elemento VH1 3’ proximal) y la diversidad de anticuerpos se genera mediante conversiïn gïnica e hipermutaciïn. Por el contrario, la conversiïn gïnica de ratïn y humana se produce muy raramente, si es que se produce. Por lo tanto, es de esperar que en animales que diversifican su repertorio de anticuerpos primarios mediante conversiïn gïnica e hipermutaciïn, un enfoque de ingenierïa genïtica basado en reordenaciïn gïnica dï como resultado animales con tïtulos bajos de anticuerpos y una diversidad de anticuerpos limitada. De este modo, la ingenierïa genïtica de animales grandes para la producciïn de preparaciones de anticuerpos sin inmunogenicidad para terapia humana requiere estrategias alternativas de ingenierïa genïtica.

La producciïn de anticuerpos humanizados en animales transgïnicos no humanos se describe en la publicaciïn PCT Nï WO 02/12437, publicada el 14 de febrero, 2002. El documento WO 02/12437 describe animales no humanos genïticamente modificados que contienen uno o mïs loci de inmunoglobulina humanizada que son capaces de someterse a reordenaciïn gïnica y a conversiïn gïnica en animales no humanos transgïnicos, incluyendo animales en los cuales la diversidad de anticuerpos se genera principalmente mediante conversiïn gïnica para producir anticuerpos humanizados diversificados. Los anticuerpos humanizados que se obtienen tienen una inmunogenicidad mïnima en seres humanos y son apropiados para su uso en el tratamiento terapïutico de sujetos humanos. Se describen adicionalmente nuevas secuencias de nucleïtidos de las regiones flanqueantes 5’ y 3’ de segmentos de la regiïn constante de cadena pesada de inmunoglobulina de varios mamïferos no humanos tales como pollos, vacas,

ovejas y conejos.... [Seguir leyendo]

1. Un vector transgïnico que comprende un locus de Ig humanizada, donde dicho locus de Ig humanizada procede de un locus de Ig o de una porciïn de un locus de Ig de un conejo, que comprende mïltiples segmentos gïnicos de 5 Ig, donde:

(a) dichos segmentos gïnicos son de la SEC ID Nï: 189, 190, 191 y 192;

(b) dichos segmentos gïnicos estïn yuxtapuestos en una configuraciïn no reordenada, parcialmente reordenada

o totalmente reordenada, y

(c) dicho locus de Ig humanizada es capaz de someterse a reordenamiento gïnico, si es necesario, y conversiïn gïnica y/o hipermutaciïn, y de producir un repertorio de inmunoglobulinas humanizadas en dicho conejo.

2. Un mïtodo para fabricar un vector transgïnico que comprende un locus de inmunoglobulina humanizada capaz

de producir un repertorio funcional de anticuerpos humanizados en un conejo, que comprende: 15

(a) obtener un fragmento de ADN que comprende un locus de Ig o una porciïn del mismo a partir de dicho conejo, que comprende al menos un segmento gïnico V, al menos un segmento gïnico J y al menos un segmento gïnico de regiïn constante; y

(b) integrar el segmento gïnico de SEC ID Nï: 189, 190, 191 y 192 dentro del fragmento de ADN de la etapa (a)

para producir un locus de Ig humanizada; donde (i) los segmentos gïnicos estïn yuxtapuestos en una configuraciïn no reordenada, parcialmente reordenada o totalmente reordenada, y (ii) el locus de Ig humanizada es capaz de someterse a reordenamiento gïnico, si es necesario, conversiïn gïnica y/o hipermutaciïn, y de producir un repertorio de inmunoglobulinas humanizadas en dicho conejo.

3. Un conejo transgïnico que comprende el locus de inmunoglobulina humanizada presente en el vector transgïnico de la reivindicaciïn 1, y que conserva una maquinaria de regulaciïn endïgena y de producciïn de anticuerpos esencialmente intacta.

4. Un linfocito B procedente del conejo transgïnico de la reivindicaciïn 3, que comprende el locus de 30 inmunoglobulina humanizada presente en el vector transgïnico de la reivindicaciïn 1.

5. Un mïtodo para producir una inmunoglobulina humanizada usando el animal transgïnico de la reivindicaciïn 3.

6. El mïtodo de la reivindicaciïn 5, caracterizado por que la inmunoglobulina humanizada es un anticuerpo. 35

7. El mïtodo de la reivindicaciïn 6, caracterizado por que la inmunoglobulina humanizada es un anticuerpo policlonal.

8. El mïtodo de la reivindicaciïn 6, caracterizado por que la inmunoglobulina humanizada es un anticuerpo 40 monoclonal.