Inmunoconjugados de miostatina para el tratamiento de atrofia muscular progresiva.

Uso de una composición que comprende un inmunoconjugado de miostatina para la preparación de un medicamento para tratar atrofia muscular progresiva en un mamífero,

en el que el inmunoconjugado comprende un transportador fusionado a un multímero de miostatina, en el que el transportador estimula la actividad de células T cooperadoras, y en el que el multímero de miostatina tiene la fórmula general (MP-XMP) y, en la que cada MP se selecciona independientemente del grupo que consiste en

a) los aminoácidos 3-15 de SEQ ID NO: 6;

b) los aminoácidos 3-17 de SEQ ID NO: 8;

c) los aminoácidos 3-16 de SEQ ID NO: 10;

d) los aminoácidos 3-22 de SEQ ID NO: 16;

e) los aminoácidos 3-19 de SEQ ID NO: 8;

f) los aminoácidos 3-18 de SEQ ID NO: 20; y

g) los aminoácidos 3-18 de SEQ ID NO: 22,

X se selecciona del grupo que consiste en: una unión peptídica; un grupo espaciador de aminoácidos; y

[MP]n, en la que n es mayor que o igual a 1; y en la que y es mayor que o igual a 1

Inmunoconjugados de miostatina para el tratamiento de atrofia muscular progresiva Campo técnico La presente invención se refiere en general a composiciones para aumentar la síntesis de músculo y tratar una enfermedad en sujetos vertebrados. Más particularmente, la invención se refiere a composiciones inmunológicas para reducir la actividad de miostatina en sujetos vertebrados.

Antecedentes de la invención Los ganaderos han usado tradicionalmente programas de cría para seleccionar los animales que producen cantidades máximas de proteína con rendimiento aceptable según se mide mediante la eficiencia alimenticia, función reproductora y salud general. Se ha observado ganado que presenta un aumento de la masa muscular debido tanto a hipertrofia como a hiperplasia de células musculares en varias razas. La incidencia más pronunciada de este estado, que se denomina doble musculatura, se da en el ganado belga azul. La masa muscular aumenta en aproximadamente el 20% con una disminución en la masa ósea y adiposa en estos animales (Shahin y Berg, Can. J. Anim. Sci. (1985) 65:279-293) . El ganado belga azul también utiliza el pienso de manera eficiente y da lugar a un mayor porcentaje de cortes de carne deseables (Casas et al., J. Anim. Sci. (1997) 75 (Supp 1) :149) . La doble musculación en el ganado belga azul se hereda y se cree que es recesiva puesto que los heterocigotos pueden ser normales o tener sólo un aumento moderado de la masa muscular.

A pesar de las ventajas de este estado, el ganado con doble musculación tiene a menudo rasgos no deseables. Por ejemplo, debido a que los terneros son generalmente un 10-38% más pesados de lo normal, son prevalentes las distocias, requiriendo partos por cesárea. Los animales también presentan una reproducción anómala debido a los aparatos reproductores escasamente desarrollados y tienen otras anomalías anatómicas tales como macroglosia. Otras razas de ganado, tales como la piamontesa del norte de Italia, tienen grados variables de doble musculatura y también muestran muchos de estos rasgos no deseables.

La característica de doble musculatura identificada en algunas razas de ganado se ha asociado ahora con mutaciones en el gen de la miostatina (Grobet et al., Nature Genetics (1997) 17:71-74; Kambadur et al., Genome Research (1997) 7:910-915; McPherron y Lee, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1997) 94:12457-12461) . Esta mutación parece dar como resultado principalmente un aumento del número de células musculares (hiperplasia) más que un aumento del tamaño de de las fibras musculares individuales (hipertrofia) . También se ha identificado un estado denominado hipertrofia muscular en la raza porcina Pietrain. Este estado no está relacionado con el gen de la miostatina y se ha identificado como mutación en un gen responsable del transporte de calcio.

McPherron et al., Nature (1997) 387:83-90, han identificado un miembro de la superfamilia de proteínas del factor de crecimiento transformante-β (TGF-β) en ratones, denominado factor de crecimiento/diferenciación-8 (GDF-8) . GDF-8 actúa como regulador negativo para el crecimiento de músculo esquelético y se expresa en músculos esqueléticos en desarrollo y de adultos. Los experimentos de desactivación génica en ratones han dado como resultado mutantes homocigotos que son un 30% más grandes que los ratones de tipo natural. Este aumento de tamaño se debe principalmente a un aumento de la masa muscular, pesando los músculos individuales de los mutantes 2-3 veces más que los de los ratones de tipo natural (McPherron et al., Nature (1997) 387:83-90) . McPherron y Lee, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1997) 94:12457-12461 y Grobet et al., Nature Genetics (1997) 17:71-74 evaluaron secuencias genómicas similares en varias especies, incluyendo ganado, y notificaron que el ganado con doble musculación tenía defectos en el gen que codifica para una proteína sumamente homóloga a GDF-8. Esta proteína se denomina ahora miostatina.

Por tanto, parece que la miostatina la producen las células musculares y regula la proliferación y diferenciación de mioblastos. En el ganado belga azul y piamontés, se cree que defectos naturales en el gen dan como resultado o bien la producción de una proteína anómala o bien una cantidad reducida de miostatina, teniendo cualquiera de ellas el efecto de aumentar el crecimiento de músculo.

Se ha identificado el gen de la miostatina de varias especies de vertebrados, incluyendo ratón, rata, ser humano, babuino, ganado, cerdo, oveja, pollo, pavo y pez cebra y se secuenciaron las proteínas (McPherron y Lee, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1997) 94:12457-12461) . La secuencia de la proteína miostatina está sumamente conservada a través de todas estas especies. De manera similar, se ha determinado la secuencia de nucleótidos para la miostatina de ratón, rata, ser humano, babuino, ganado, cerdo, oveja, pollo y pavo. Véanse, por ejemplo, la patente estadounidense nº 5.827.733 para las secuencias de nucleótidos de miostatina murina y humana; la publicación internacional nº WO 99/02667 para la secuencia de nucleótidos de miostatina bovina; la publicación internacional nº WO 98/33887, para las secuencias de nucleótidos de miostatina de rata, de ser humano, de babuino, bovina, porcina, ovina, de pollo y de pavo.

La secuencia de nucleótidos del gen de la miostatina predice una proteína de aproximadamente 376 aminoácidos

con un peso molecular de aproximadamente 43 kDa. Esta proteína contiene una secuencia líder de secreción y un sitio de procesamiento proteolítico que libera un péptido de 13 KDa, que contiene 9 residuos de cisteína. La miostatina clonada expresada en células de ovario de hámster chino produce dos proteínas. La primera tiene un peso molecular aparente de aproximadamente 52 kDa y la segunda de aproximadamente 15 kDa. En condiciones no reductoras, estas proteínas parecen ser dímeros con pesos moleculares de aproximadamente 101 kDa y 25 kDa (McPherron et al., Nature (1997) 387:83-90) .

Los investigadores han propuesto la inserción de genes de la miostatina mutados en sujetos animales para la producción de especies transgénicas que tienen un aumento del tejido muscular. Véase, por ejemplo, la publicación internacional nº WO 98/33887. Sin embargo, tales enfoques plantean varios inconvenientes. Por ejemplo, debido a que el gen de la miostatina se vuelve activo durante la fase embrionaria, la producción reducida de miostatina provoca un desarrollo excesivo de músculo en el útero. Por tanto, los animales transgénicos que incluyen genes mutados requerirán probablemente un parto por cesárea, una pesada carga para los ganaderos. Adicionalmente, existe una oposición pública a los animales modificados mediante ingeniería genética para el consumo humano y serán deseables otros métodos de producción de tales animales.

Divulgación de la invención La presente invención se refiere al uso de un inmunoconjugado de miostatina multimérico para la preparación de un medicamento para tratar atrofia muscular progresiva en un mamífero, tal como se define en las reivindicaciones adjuntas. Debido a la naturaleza ubicua de la miostatina, las composiciones y los métodos descritos en el presente documento encuentran un uso en una amplia variedad de sujetos vertebrados, tal como se describe adicionalmente a continuación.

De manera sorprendente, la invención logra estos resultados mediante técnicas inmunológicas. Es bien sabido en la técnica que la inmunización frente a moléculas endógenas, tales como miostatina, es problemática debido a que el sistema inmunitario no reconoce tales moléculas “propias”. Por tanto, la presente invención proporciona una solución a un problema con el que se encontraría uno normalmente cuando se inmuniza frente a una sustancia endógena.

Se da a conocer en el presente documento un péptido de miostatina que consiste en de aproximadamente 3 a aproximadamente 100 aminoácidos. El péptido comprende al menos un epítopo de miostatina. El péptido de miostatina puede derivarse de la región de miostatina que abarca los aminoácidos 45 a 376, inclusive, de las figuras 1A-1D (SEQ ID NO: 27-36) o los aminoácidos 235 a 376, inclusive, de las figuras 1A-1D (SEQ ID NO: 27-36) .

El péptido de miostatina puede tener una identidad de aminoácidos de al menos aproximadamente el 75% con un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en los aminoácidos 318, inclusive, de SEQ ID NO: 4; los aminoácidos 3-15, inclusive, de SEQ ID NO: 6; los aminoácidos 3-17, inclusive, de SEQ ID NO: 8; los aminoácidos 3-16, inclusive, de SEQ ID NO: 10; los aminoácidos 3-22, inclusive, de SEQ ID NO: 12; los aminoácidos 3-25, inclusive, de SEQ ID NO: 14; los aminoácidos... [Seguir leyendo]

1. Uso de una composición que comprende un inmunoconjugado de miostatina para la preparación de un medicamento para tratar atrofia muscular progresiva en un mamífero, en el que el inmunoconjugado comprende un transportador fusionado a un multímero de miostatina, en el que el transportador estimula la actividad de células T cooperadoras, y en el que el multímero de miostatina tiene la fórmula general (MP-XMP) y, en la que cada MP se selecciona independientemente del grupo que consiste en a) los aminoácidos 3-15 de SEQ ID NO: 6;

b) los aminoácidos 3-17 de SEQ ID NO: 8;

c) los aminoácidos 3-16 de SEQ ID NO: 10;

d) los aminoácidos 3-22 de SEQ ID NO: 16;

e) los aminoácidos 3-19 de SEQ ID NO: 8;

f) los aminoácidos 3-18 de SEQ ID NO: 20; y

g) los aminoácidos 3-18 de SEQ ID NO: 22,

X se selecciona del grupo que consiste en: una unión peptídica; un grupo espaciador de aminoácidos; y [MP]n, en la que n es mayor que o igual a 1; y en la que y es mayor que o igual a 1.

2. Uso según la reivindicación 1, en el que la atrofia muscular progresiva está provocada por un trastorno seleccionado del grupo que consiste en atrofia muscular, anorexia, caquexia, distrofia facioescapulohumeral, miopatía ocular y distrofia miotónica.

3. Uso según la reivindicación 1, en el que la atrofia muscular progresiva está provocada por distrofia muscular.

4. Uso según la reivindicación 3, en el que la distrofia muscular es de Becker o de Duchennes.

5. Uso según la reivindicación 3, en el que la distrofia muscular se selecciona del grupo que consiste en de Becker, pseudohipertrófica, de cintura y extremidades, de Dejerine-Landouzy, de Duchennes, de Landouzy, de Emer y -Dreifuss, de Erb, de Fukuyama, de Gowers, neuroaxonal infantil, de Ley den-Moblus, oculofaríngea, pelvifemoral, progresiva, escapulohumeral, distal y de Simmerlin.

6. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que el transportador se selecciona del grupo que consiste en hemocianina de lapa californiana, toxoide tetánico, ovoalbúmina, un polipéptido de leucotoxina (LKT) y mioglobina de esperma de ballena.

7. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que el transportador es un polipéptido de

leucotoxina (LKT) y el multímero de miostatina comprende al menos dos copias de los aminoácidos 3-15 de SEQ ID NO: 6.

8. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que el transportador es un polipéptido de leucotoxina (LKT) y el multímero de miostatina consiste en ocho copias de los aminoácidos 3-15 de SEQ ID NO: 6.

9. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que el transportador es un polipéptido de leucotoxina (LKT) y el multímero de miostatina comprende al menos dos copias de los aminoácidos 3-17 de SEQ ID NO: 8.

10. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que el transportador es un polipéptido de leucotoxina (LKT) y el multímero de miostatina consiste en ocho copias de los aminoácidos 3-17 de SEQ ID NO: 8.

11. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que el transportador es un polipéptido de leucotoxina (LKT) y el multímero de miostatina comprende al menos dos copias de los aminoácidos 3-16 de SEQ ID NO: 10.

12. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que el transportador es un polipéptido de

leucotoxina (LKT) y el multímero de miostatina consiste en ocho copias de los aminoácidos 3-16 de SEQ ID NO: 10.

13. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que el transportador es un polipéptido de leucotoxina (LKT) y el multímero de miostatina comprende al menos dos copias de los aminoácidos 3-22 de SEQ ID NO: 16.

14. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que el transportador es un polipéptido de leucotoxina (LKT) y el multímero de miostatina consiste en seis copias de los aminoácidos 3-22 de SEQ ID NO: 16.

15. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que el transportador es un polipéptido de leucotoxina (LKT) y el multímero de miostatina comprende al menos dos copias de los aminoácidos 3-19 de SEQ ID NO: 18.

16. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que el transportador es un polipéptido de leucotoxina (LKT) y el multímero de miostatina consiste en cuatro copias de los aminoácidos 3-19 de SEQ ID NO: 18.

17. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que el transportador es un polipéptido de leucotoxina (LKT) y el multímero de miostatina comprende al menos dos copias de los aminoácidos 3-18 de 20 SEQ ID NO: 20.

18. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que el transportador es un polipéptido de leucotoxina (LKT) y el multímero de miostatina consiste en ocho copias de los aminoácidos 3-18 de SEQ ID NO: 20.

19. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que el transportador es un polipéptido de leucotoxina (LKT) y el multímero de miostatina comprende al menos dos copias de los aminoácidos 3-18 de SEQ ID NO: 22.

20. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que el transportador es un polipéptido de leucotoxina (LKT) y el multímero de miostatina consiste en cuatro copias de los aminoácidos 3-18 de SEQ ID NO: 22 fusionado a un polipéptido de LKT.

21. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que el grupo espaciador de los aminoácidos incluye 35 al menos un epítopo de células T cooperadoras.

22. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que el inmunoconjugado comprende además un adyuvante.

23. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que el mamífero es un ser humano.