Glucanos con adyuvante.

Composición inmunógena que comprende un glucano que contiene enlaces β

-1,3 y/o enlaces β-1,6, en la que dicho glucano es una especie molecular única y está conjugado con una proteína transportadora, y en la que el glucano comprende una o más secuencias de al menos cinco residuos no terminales adyacentes unidos a otros residuos sólo mediante enlaces β-1,3

DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona una composición ¡nmunógena que comprende un glucano que contiene enlaces (3-1,3 y/o enlaces (3-1,6, en la que dicho glucano es una especie molecular única y está conjugado con una proteína transportadora, y en la que el glucano comprende una o más secuencias de al menos cinco residuos no terminales adyacentes unidos a otros residuos sólo mediante enlaces (3-1,3. Los autores de la invención han descubierto que los glucanos que son especies moleculares únicas pueden ser más inmunogénicos que los glucanos más polidispersos, particularmente cuando la composición comprende también un adyuvante. Por lo tanto, la composición comprende preferentemente un adyuvante además del glucano.

El glucano

Los glucanos son polisacáridos que contienen glucosa que se encuentran Ínter alia en las paredes de las células fúngicas. Los a-glucanos incluyen uno o más enlaces a entre las subunidades de glucosa, mientras que los p-glucanos incluyen uno o más enlaces p entre las subunidades de glucosa. El glucano utilizado según la invención incluye enlaces p, y puede contener sólo enlaces p (es decir, no contiene enlaces a).

El glucano puede comprender uno o más enlaces p-1,3 y/o uno o más enlaces p-1,6. También puede comprender uno o más enlaces p-1,2 y/o enlaces (3-1,4, pero normalmente sus únicos enlaces p serán enlaces p-1,3 y/o enlaces p-1,6.

El glucano puede ser ramificado o lineal.

Los p-glucanos naturales de longitud completa son insolubles y tienen un peso molecular en el rango de los megadaltons. Resulta preferente utilizar glucanos solubles en las composiciones inmunógenas de la invención. La solubilización puede conseguirse fragmentando glucanos insolubles largos. Esto puede conseguirse mediante hidrólisis o, más convenientemente, mediante digestión con una glucanasa (por ejemplo, con una p-1,3-glucanasa o una p-1,6-glucanasa). Como alternativa, pueden prepararse sintéticamente glucanos cortos uniendo unidades estructurales de monosacáridos.

Resultan preferentes los glucanos de bajo peso molecular, particularmente aquellos con un peso molecular inferior a 1 kDa (por ejemplo, inferior a 8, 7, 6, 5, 4, 3, 25, 2 ó 15kDa). También es posible utilizar oligosacáridos por ejemplo que contengan 6 o menos (por ejemplo, 59, 58, 57, 56, 55, 54, 53, 52, 51, 5, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 4, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 3, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 2, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 1, 9, 8, 7, 6, 5, 4) unidades de monosacárido glucosa. Dentro de este intervalo, resultan preferentes los oligosacáridos que tienen entre 1 y 5 o entre 2 y 4 unidades de monosacárido.

El glucano puede ser un glucano fúngico. Un "glucano fúngico" se obtiene generalmente a partir de un hongo pero, cuando se encuentra una estructura concreta de glucano tanto en hongos como en no hongos (por ejemplo, en bacterias, plantas inferiores o algas), puede utilizarse el organismo no fúngico como fuente alternativa. Por lo tanto, el glucano puede provenir de la pared celular de una Candida, tal como C. albicans, o de Coccidioides immitis, Tríchophyton verrucosum, Blastomyces dermatidis, Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Saccharomyces cerevisiae, Paracoccidioides brasiliensis o Pythiumn insidiosum.

Existen diversas fuentes de p-glucanos fúngicos. Por ejemplo, se dispone en el mercado de p-glucanos puros por ejemplo, el pustulano (Calbiochem) es un p-1,6-glucano purificado a partir de Umbilicaria papullosa. Los P-glucanos pueden purificarse a partir de paredes de las células fúngicas de diversas maneras. En la referencia 7, por ejemplo, se describe un procedimiento de dos etapas para preparar un extracto de p-glucano soluble en agua de Candida, libre de manano de la pared celular, que implica la oxidación con NaCIO y la extracción con DMSO. El producto resultante ("p-D-glucano soluble de Candida" o `"CSBG") se compone principalmente de un p-1,3-glucano lineal con un resto p-1,6-glucano lineal. Asimismo, en la referencia 2 se describe la producción de GG-zym a partir de C. albicans. Tales glucanos de C. albicans, incluyen (a) p-1,6-glucanos con cadenas laterales de p-1,3-glucano y un grado medio de polimerización de aproximadamente 3, y (b) p-1,3-glucanos con cadenas laterales de p-1,6-glucano y un grado medio de polimerización de aproximadamente 4.

En algunas formas de realización de la invención, el glucano es un p-1,3 glucano con algunas ramificaciones p-1,6, como se observa, por ejemplo, en las laminarinas. Las laminarinas se encuentran en las algas pardas y algas marinas. Las relaciones P(1-3):p(1-6) de las laminarinas varían entre las diferentes fuentes, por ejemplo es tan baja como 3:2 en la laminarina de Eisenia bicyclis, pero tan alta como 7:1 en la laminarina de Laminaria digititata [8]. Por lo tanto, el glucano utilizado con la invención puede tener una relación P(1-3):P(1-6) de entre 1,5:1 y 7,5:1, por ejemplo aproximadamente 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1 ó 7:1. Opcionalmente, el glucano puede tener una subunidad de manitol terminal, por ejemplo un residuo de manitol con enlaces 1,1-a [9]. El glucano también puede comprender subunidades de mañosa.

En otras formas de realización, el glucano tiene exclusivamente o principalmente enlaces p-1,3, como se observa en el curdlan. Los autores de la invención han descubierto que estos glucanos pueden ser más inmunogénicos que los glucanos que comprenden otros enlaces, particularmente los glucanos que comprenden

enlaces p-1,3 y una mayor proporción de enlaces (3-1,6. Por lo tanto, el glucano puede hacerse únicamente de residuos de glucosa con enlaces p-1,3 (por ejemplo, p-D-glucopiranosas lineales con enlaces exclusivamente 1,3). Sin embargo, opcionalmente, el glucano puede incluir residuos de monosacárldo que no sean residuos de glucosa con enlaces p-1,3, por ejemplo puede Incluir residuos de glucosa con enlaces p-1,6. La relación entre residuos de glucosa con enlaces p-1,3 y estos otros residuos debe ser al menos 8:1 (por ejemplo >9:1, >1:1, £11:1, £12:1, >13:1, >14:1, >15:1, >16:1, >17:1, >18:1, >19:1, >2:1, >25:1, >3:1, >35:1, >4:1, >45:1, >5:1, >75:1, >1:1, etc.) Existen una o más secuencias (por ejemplo, £1, £2, £3, £4, £5, £6, £7, £8, £9, £1, £11, £12, etc.) de al menos cinco (por ejemplo £5, £6, £7, £8, £9, £1, £11, £12, £13, £14, £15, £16, £17, £18, £19, £2, £3, £4, £5, £6, etc.) residuos no terminales adyacentes unidos a otros residuos sólo mediante enlaces p-1,3. "No terminal" se refiere a que el residuo no está presente en un extremo libre del glucano. En algunas formas de realización, los residuos no terminales adyacentes pueden no incluir ningún residuo acoplado a una molécula transportadora, conectar u otro espaciador como se describe más adelante. Los autores de la invención han descubierto que la presencia de cinco residuos no terminales adyacentes unidos a otros residuos sólo mediante enlaces p-1,3 puede proporcionar una respuesta de anticuerpos protectora, por ejemplo, contra C. albicans.

En otras formas de realización, una composición puede incluir dos glucanos diferentes, por ejemplo un primer glucano con una relación p(1-3):p(1-6) de entre 1,5:1 y 7,5:1, y un segundo glucano que tiene exclusivamente o principalmente enlaces p-1,3. Por ejemplo, una composición puede incluir un glucano de laminarina y un glucano de curdlan.

Cuando un p-glucano incluye enlaces p-1,3 y p-1,6 en una relación y/o secuencia deseada, este glucano puede encontrarse en la naturaleza (por ejemplo, un laminarina) o puede generarse artificialmente. Por ejemplo, puede generarse mediante síntesis química, en parte o en su totalidad. Los métodos para la síntesis química de P-1,3/p-1,6 glucanos son bien conocidos en la técnica, por ejemplo a partir de las referencias 1-2. También puede generarse un p-glucano que incluya enlaces p-1,3 y p-1,6 en una relación deseada partiendo de un glucano disponible y tratándolo con una p-1,6-glucanasa (también conocida como glucano endo-1,6-p-glucosidasa, 1,6-p-D-glucano glucanohidrolasa, etc.; EC 3.2.1.75) o una p-1,3-glucanasa (tal como una exo-1,3-glucanasa (EC 3.2.1.58) o una endo-1,3-glucanasa (EC 3.2.1.39) hasta alcanzar una relación y/o secuencia deseada.

Cuando se desee un glucano que contenga exclusivamente glucosa con enlaces p-1,3, el tratamiento con P-1,6-glucanasa puede continuarse hasta su finalización, ya que la p-1,6-glucanasa producirá finalmente p-1,3 glucano puro. Sin embargo, más convenientemente, puede utilizarse un p-1,3-glucano puro. Estos pueden generarse sintéticamente, mediante síntesis química y/o enzimática, por ejemplo utilizando una (1> 3)-p-D-glucano sintasa, de las que se conocen... [Seguir leyendo]

1. Composición inmunógena que comprende un glucano que contiene enlaces (3-1,3 y/o enlaces (3-1,6, en la que dicho glucano es una especie molecular única y está conjugado con una proteína transportadora, y en la que el glucano comprende una o más secuencias de al menos cinco residuos no terminales adyacentes unidos a otros residuos sólo mediante enlaces (3-1,3.

2. Composición según la reivindicación 1, en la que el glucano está conjugado con la proteína transportadora directamente o a través de un conector.

3. Composición según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la que la proteína transportadora es un toxoide o toxina bacteriana, o un muíante de los mismos, preferentemente en la que la proteína transportadora es CRM197.

4. Composición según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el glucano tiene un peso molecular inferior a 1 kDa y/o el glucano tiene 6 o menos unidades de monosacárido glucosa.

5. Composición según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el glucano es un (3-1,3 glucano con algunas ramificaciones (3-1,6, preferentemente en la que el glucano es un laminarina.

6. Composición según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el glucano comprende residuos de glucosa con enlaces (3-1,3 y residuos de glucosa con enlaces (3-1,6, con una relación entre residuos de glucosa con enlaces (3-1,3 y residuos con enlaces (3-1,6 de al menos 8:1.

7. Composición según la reivindicación 5, en la que el glucano es laminarina y comprende residuos de glucosa con enlaces (3-1,3 y residuos de glucosa con enlaces (3-1,6, con una relación entre residuos de glucosa con enlaces (3-1,3 y residuos con enlaces (3-1,6 de al menos 8:1.

8. Composición según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el glucano tiene exclusivamente enlaces (3-1,3.

9. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, en la que el glucano es un curdlan.

1. Composición según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que incluye un vehículo farmacéuticamente aceptable.

11. Composición según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la composición comprende adicionalmente un adyuvante.

12. Composición según la reivindicación 11, en la que el adyuvante comprende uno o más de entre: una sal de aluminio; una emulsión de aceite en agua; un oligonucleótido inmunoestimulador; y/o una a-glucosilceramida, preferentemente en la que el adyuvante comprende un oligonucleótido inmunoestimulador y un oligopéptido policatiónico.

13. Composición según la reivindicación 12, en la que el adyuvante es MF59.

14. Composición según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el glucano tiene una polidispersidad

(Mw/Mn) de 1,1 o menos.

15. Composición según cualquiera de las reivindicaciones anteriores para su uso en un método para provocar una respuesta inmunitaria en un mamífero, que comprende administrar al mamífero la composición.