Genes de Delta-8 desaturasa, enzimas codificadas por los mismos y usos de los mismos.

Un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene actividad desaturasa,

donde la secuencia de aminoácidos del polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID Nº 29.

Genes de Delta-8 desaturasa, enzimas codificadas por los mismos y usos de los mismos

Campo de la invención La presente invención se refiere a polinucleótidos aislados que codifican una delta-8 desaturasa, las delta-8 desaturasas codificadas por los polinucleótidos aislados, vectores de expresión que contienen los polinucleótidos aislados, células huésped que contienen los vectores de expresión y métodos para producir delta-8 desaturasas y ácidos grasos poliinsaturados.

Antecedentes Los ácidos grasos poliinsaturados (PUFA) tienen muchos papeles en el funcionamiento apropiado de todas las formas de vida. Por ejemplo los PUFA son componentes importantes de la membrana plasmática de las células, en donde se encuentran en forma de fosfolípidos. Los PUFA son necesarios para el desarrollo apropiado del cerebro infantil, así como para la formación y la reparación de tejidos en mamíferos maduros.

Varias enzimas, sobre todo desaturasas y elongasas, están implicadas en la biosíntesis de PUFA (Véase la Figura 1) . Las desaturasas catalizan la introducción de insaturaciones (por ejemplo enlaces dobles) entre los átomos de carbono en la cadena alquil del ácido graso del sustrato. Las elongasas catalizan la adición de una unidad de 2 carbonos a un sustrato ácido graso. Por ejemplo, el ácido linoleico (LA, 18:2 n-6) se produce a partir del ácido oleico (OA, 18:1n-9) por la acción de una !12-desaturasa. El ácido eicosadienoico (EDA, 20: 2 n-6) se produce a partir del LA por la acción de una !9-elongasa. El ácido dihomo-∀-linolénico (DGLA, 20:3 n-6) se produce a partir del EDA por

acción de una !8-desaturasa (Véase la Figura 1) . El ácido araquidónico (ARA, 20:4 n-6) se produce a partir de DGLA por acción de una !5-desaturasa (Véase la Figura 1) .

Varios PUFA de cadena larga importantes se conocen en la técnica. Por ejemplo, uno de los más importantes PUFA de cadena larga es el ácido eicosapentaenoico (EPA) . El EPA se encuentra en hongos y en aceites marinos. Un segundo PUFA de cadena larga importante es el ácido docosahexaenoico (DHA) . El DHA se encuentra más a menudo en aceite de pescado y también se puede purificar del tejido cerebral de mamíferos. Un tercer PUFA de cadena larga importante es el ARA. El ARA se encuentra en hongos filamentosos y también se puede purificar a partir de tejidos de mamíferos incluyendo el hígado y las glándulas adrenales.

El ARA, EPA y/o DHA, se pueden producir tanto por medio de la ruta alternativa !8-desaturasa / !9-elongasa como por medio de la ruta convencional de la !6-desaturasa (Véase la Figura 1) . Se habían identificado anteriormente elongasas activas sobre el sustrato de ácidos grasos en la ruta convencional !6-desaturasa para la producción de PUFA de cadena larga, particularmente ARA, EPA y DHA. La ruta convencional de la !6-desaturasa para convertir el LA en DGLA y el ácido alfa-linolénico (ALA) en ácido #3-eicosatetraenoico (#3-ETA) utiliza la enzima !6desaturasa para convertir el LA en ácido gamma-linolénico (GLA) y el ALA en ácido estearidónico (SDA) ; y la enzima C18-elongasa convierte el GLA en DGLA y el SDA en #3-ETA. Sin embargo en ciertas situaciones puede preferirse la ruta alternativa !8-desaturasa / !9-elongasa sobre la ruta convencional de la !6-desaturasa. Por ejemplo, si no se desea la presencia de ciertos ácidos grasos omega-6 u omega-3 residuales intermedios, tales como GLA o SDA, durante la producción del DGLA, ARA, #3-ETA, EPA, ácido #3-docosapentaenoico (DPA) y/o DHA, se puede utilizar

la ruta alternativa !8-desaturasa / !9-elongasa como alternativa a la ruta convencional de la !6-desaturasa para evitar la formación de GLA y SDA. Las !8-desaturasas son útiles en esta ruta porque desnaturalizan un ácido graso entre el octavo y noveno átomo de carbono (numerados a partir del extremo carboxilo de la molécula) y pueden, por ejemplo, catalizar la conversión del ácido #6-eicosadienoico (EDA) en DGLA y/o el ácido #3-eicosatrienoico (#3-ETrA) en #3-ETA. Por lo tanto, existe una necesidad en la técnica para nuevas fuentes de !8-desaturasas que puedan utilizarse en la producción de PUFA de cadena larga.

El documento WO 2007/127381 desvela fragmentos aislados de un ácido nucleico y construcciones recombinantes que comprenden tales fragmentos que codifican una !8-desaturasa y el uso de la desaturasa para la fabricación de ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga. La !8-desaturasa se derivó de Pavlova lutheri CCMP 459. Zhou y 55 col. Phytochemistr y , 2007, Vol. 68, p. 785-796 desvela el aislamiento y caracterización de tres desaturasas del extremo frontal de ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga de Pavlova salina que tenían especificidad !4, !5 y !8. Zhou y col. informaron de que el grado máximo de identidad entre la desaturasa de P. salina y otras desaturasas clonadas con la !8-desaturasa de Acanthamoeba castellanii era del 29%. Además Zhou y col. investigaron la expresión de la !8-desaturasa de P. salina en Arabidopsis. La expresión demostró que la !8desaturasa de P. salina podía desaturar ácidos grasos !6 y !9. Bell y col., Phytochemistr y , 1996, Vol. 41, Nº 2, p. 465-471 desvela un estudio en el que se cultivaron axénicamente tipos celulares flagelados y cocolitos de Emiliana huxleyi, y se examinaron la clase de lípido y la composición en ácidos grasos de las clases principales de lípidos polares a lo largo del ciclo de crecimiento. Singh y col., Current Opinion in Plant Biology, 2005, Vol. 8, Nº 2, p. 197203, plantea las dificultades implicadas en la manipulación metabólica de plantas para expresar altos niveles de nuevos ácidos grasos que tengan importancia nutricional e industrial. Napier, Annual Review of Plant Biology, 2007, Vol. 58, p. 295-319 desvela la producción de varios ácidos grasos en plantas transgénicas, incluyendo los factores responsables de la variación de los resultados y el potencial para optimizar más la producción transgénica de ácidos grasos.

Sumario de la invención En un aspecto, la presente invención se refiere a un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene actividad desaturasa, en el que la secuencia de aminoácidos del polipéptido comprende la SEC ID Nº 29. El ácido nucleico aislado codifica una enzima !8-desaturasa funcionalmente activa que utiliza como sustrato el ácido #6-eicosadienoico o el ácido #3-eicosatrienoico. Esta secuencia de ácido nucleico aislado puede derivarse de Emiliana huxleyi, preferentemente de la Emiliana huxleyi CCMP 378.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a una secuencia de nucleótidos aislada que comprende la secuencia de nucleótidos SEC ID Nº 28 o que comprende al menos el 90% de la secuencia de nucleótidos SEC ID Nº 30, en el que la secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido que tiene actividad desaturasa. La secuencia de nucleótidos aislada codifica una enzima !8-desaturasa funcionalmente activa que utiliza como sustrato el ácido #6eicosadienoico o el ácido #3-eicosatrienoico. La secuencia de nucleótidos aislada puede tener una secuencia SEC ID Nº 28. De manera alternativa, la secuencia de nucleótidos aislada puede tener una secuencia SEC ID Nº 30. La secuencia de nucleótidos aislada se puede derivar de Emiliana huxleyi, preferentemente de Emiliana huxleyi CCMP

378.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a un vector de expresión. El vector de expresión de la presente invención comprende una secuencia de nucleótidos unida operativamente a una secuencia reguladora, en donde la secuencia de nucleótidos comprende la secuencia de nucleótidos SEC ID Nº 28 o comprende al menos el 90% de la secuencia de nucleótidos SEC ID Nº 30, en donde la secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido que tiene actividad desaturasa.

En otro aspecto más, la presente invención se refiere a una célula huésped que comprende el vector de expresión descrito anteriormente. La célula huésped puede ser una célula eucariota. Específicamente, la célula eucariota se selecciona de entre el grupo que consiste en una célula de mamífero, una célula de insecto, una célula vegetal, o una célula fúngica. Ejemplos de células fúngicas que se pueden utilizar son células fúngicas seleccionadas de entre el grupo que consiste en; Saccharomyces spp., Candida spp., Lipomyces spp., Yarrowia spp., Kluyveromyces spp., Hansenula spp., Aspergillus spp., Penicillium spp., Neurospora spp., Trichoderma spp., y Pichia spp. Los ejemplos de células vegetales que se pueden utilizar se seleccionan de entre el grupo que consiste en: soja, especies de Brassica, cártamo, girasol, maíz, algodón y lino.

En otro aspecto más, la presente invención se refiere a una célula vegetal, una semilla... [Seguir leyendo]

1. Un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene actividad desaturasa, donde la secuencia de aminoácidos del polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos 5 SEC ID Nº 29.

2. Una secuencia de nucleótidos aislada que comprende la secuencia de nucleótidos SEC ID Nº 28 o que comprende al menos un 90% de la secuencia de nucleótidos SEC ID Nº 30, donde la secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido que tiene actividad desaturasa.

3. La secuencia de nucleótidos aislada de la reivindicación 2, donde la secuencia codifica una enzima !8-desaturasa funcionalmente activa que utiliza el ácido #6-eicosadienoico o el ácido #3-eicosatrienoico como sustrato.

4. Un vector de expresión que comprende:

una secuencia de nucleótidos unida operativamente a una secuencia reguladora, donde la secuencia de nucleótidos comprende la secuencia de nucleótidos SEC ID Nº 28 o comprende al menos el 90% de la secuencia de nucleótidos SEC ID Nº 30, donde la secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido que tiene actividad desaturasa.

5. Una célula huésped que comprende el vector de la reivindicación 4.

6. La célula huésped de la reivindicación 5, donde la célula huésped es una célula eucariota, donde la célula

eucariota se selecciona de entre el grupo que consiste en: una célula de mamífero, una célula de insecto, una célula 25 vegetal y una célula fúngica.

7. Una célula vegetal, semilla de una planta, planta o tejido vegetal que comprende el vector de la reivindicación 4, donde la expresión de la secuencia de nucleótidos del vector da como resultado la producción de al menos un ácido graso poliinsaturado por la célula vegetal, semilla de la planta, planta o tejido vegetal.

8. La célula vegetal, semilla de una planta, planta o tejido vegetal de la reivindicación 7, donde el ácido graso poliinsaturado se selecciona de entre el grupo que consiste en ácido araquidónico (ARA) , ácido eicosapentaenoico (EPA) , ácido docosahexaenoico (DHA) , ácido dihomo-gamma-linolénico (DGLA) u #3-eicosatetraenoico (#3-ETA) y combinaciones de los mismos.

9. Un polipéptido purificado codificado por una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia de nucleótidos SEC ID Nº 28 o que comprende al menos el 90% de la secuencia de nucleótidos SEC ID Nº 30, donde el polipéptido purificado tiene actividad desaturasa.

10. Un polipéptido purificado que desatura un sustrato de ácidos grasos de 20 carbonos de largo (C20-PUFA) entre el átomo de carbono 8 y el átomo de carbono 9 del sustrato y donde el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID Nº 29.

11. El polipéptido purificado de la reivindicación 10, donde el polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos SEC 45 ID Nº 29.

12. Un método de producción de una enzima !8-desaturasa, comprendiendo el método las etapas de:

a) aislar una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia de nucleótidos SEC ID Nº 28 o que comprende al menos el 90% de la secuencia de nucleótidos SEC ID Nº 30, donde la secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido que tiene actividad !8-desaturasa. b) construir un vector de expresión que comprende la secuencia de nucleótidos aislada de la etapa a) unida operativamente a una secuencia reguladora; e c) introducir el vector de expresión en una célula huésped durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para 55 la producción de la enzima !8-desaturasa.

13. Un método para producir un ácido graso poliinsaturado que comprende las etapas de:

a) aislar una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia de nucleótidos SEC ID Nº 28 o que comprende al menos el 90% de la secuencia de nucleótidos SEC ID Nº 30, donde la secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido que tiene actividad !8-desaturasa. b) construir un vector de expresión que comprende la secuencia de nucleótidos aislada de la etapa a) unida operativamente a una secuencia reguladora; c) introducir el vector de expresión en una célula huésped durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para 65 la producción de una enzima !8-desaturasa; y d) exponer la enzima !8-desaturasa expresada a un sustrato seleccionado de entre el grupo que consiste en; ácido #6-eicosadienoico, ácido #3-eicosatrienoico y combinaciones de los mismos con el fin de convertir el sustrato en un producto ácido graso poliinsaturado.

14. El método de la reivindicación 13, donde el producto ácido graso poliinsaturado es el ácido dihomo-gammalinolénico (DGLA) , #3-eicosatetraenoico (#3-ETA) o cualquier combinación de los mismos.

15. El método de la reivindicación 13, que comprende además la etapa de:

exponer el producto ácido graso poliinsaturado a al menos una desaturasa adicional o a una elongasa con el fin de convertir el producto ácido graso poliinsaturado en otro o adicional ácido graso poliinsaturado.

16. Un método para producir ácidos grasos poliinsaturados en una célula huésped que comprende las etapas de:

a) aislar una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia de nucleótidos SEC ID Nº 28 o comprende al menos el 90% de la secuencia de nucleótidos SEC ID Nº 30, donde la secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido que tiene actividad !8-desaturasa; b) construir un vector de expresión que comprende la secuencia de nucleótidos aislada de la etapa a) unida operativamente a una secuencia reguladora;

c) introducir el vector de expresión de b) y al menos una construcción ADN recombinante adicional que comprende una secuencia de nucleótidos aislada unida operativamente a al menos una secuencia reguladora que codifica una delta-9 elongasa en una célula huésped; d) exponer la enzima !8-desaturasa y la delta-9 elongasa expresadas a un sustrato seleccionado de entre el grupo que consiste en: ácido linoleico (LA) , ácido alfa-linolénico (ALA) y combinaciones de los mismos con el fin de convertir el sustrato en un producto ácido graso poliinsaturado.

17. El método de la reivindicación 16, donde el producto ácido graso poliinsaturado es el ácido dihomo-gammalinolénico (DGLA) o el ácido #3-eicosatetraenoico (#3-ETA) o cualquier combinación de los mismos.

18. El método de la reivindicación 16, que comprende además la etapa de: exponer el producto ácido graso poliinsaturado a al menos una desaturasa adicional o a una elongasa con el fin de convertir el producto ácido graso poliinsaturado en otro o adicional ácido graso poliinsaturado.

19. El método de la reivindicación 18, donde el otro o adicional ácido graso poliinsaturado es el ácido araquidónico 35 (ARA) , ácido eicosapentaenoico (DPA) , ácido docosahexaenoico (DHA) o cualquier combinación de los mimos.