Fitasas de Buttiauxella sp. variantes que tienen propiedades alteradas.

Variante de fitasa aislada, comprendiendo dicha variante la secuencia mostrada en la figura 1C y que tiene actividad específica aumentada.

Fitasas de Buttiauxella sp. variantes que tienen propiedades alteradas Campo de la invención La presente invención se refiere a fitasas de Buttiauxella spp. variantes, a ácidos nucleicos que codifican para las fitasas y a un método de expresión heteróloga. Las fitasas englobadas por la invención pueden usarse en aplicaciones industriales incluyendo métodos para licuefacción de almidón, fermentaciones alcohólicas y para potenciar la digestión de fosfato en alimentos y piensos.

Antecedentes de la invención El fósforo (P) es un elemento esencial para el crecimiento. Una cantidad sustancial del fósforo encontrado en alimento para ganado convencional, por ejemplo, granos de cereales, harina de semillas oleaginosas y subproductos que se originan a partir de semillas, está en forma de fosfato que se une covalentemente en una molécula conocida como fitato. La biodisponibilidad del fósforo en esta forma generalmente es bastante baja para animales no rumiantes, tales como aves de corral y cerdos, porque carecen de enzimas digestivas para separar el fósforo de la molécula de fitato.

Pueden indicarse varias consecuencias importantes de la incapacidad de los animales no rumiantes para utilizar fitato. Por ejemplo, se incurre en gasto cuando se añade fósforo inorgánico (por ejemplo, fosfato de dicalcio, fosfato desfluorado) o productos animales (por ejemplo, harina de carne y huesos, harina de pescado) para cumplir los requisitos nutricionales de los animales para el fósforo. Adicionalmente, el fitato puede unirse a o quelar varios minerales (por ejemplo, calcio, zinc, hierro, magnesio y cobre) en el tracto gastrointestinal, convirtiéndolos de ese modo en no disponibles para la absorción. Además, la mayoría del fitato presente en alimento para animales pasa a través del tracto gastrointestinal, elevando la cantidad de fósforo en el estiércol. Esto conduce a un aumento de la carga de fósforo ecológica en el entorno.

Se ha encontrado que la fitasa microbiana, como aditivo de alimento para animales, mejora la biodisponibilidad del fósforo de fitato en dietas típicas de animales no rumiantes (véase, por ejemplo, Cromwell, et al, 1993) . El resultado es una disminución de la necesidad de añadir fósforo inorgánico a los piensos, así como niveles de fósforo inferiores en el estiércol excretado (véase, por ejemplo, Kornegay, et al, 1996) . Además de un aditivo de alimento para animales, las fitasas pueden usarse para la producción de fracciones de alimento para animales con poca cantidad de fitina. Por ejemplo, pueden usarse fitasas en la molienda en húmedo de granos para la producción de, por ejemplo, líquido de maceración del maíz con poca cantidad de fitina y gluten de maíz con poca cantidad de fitina o en un procedimiento de molienda en seco en combinación con enzimas que hidrolizan almidón para la producción de glucosa y alcoholes (por ejemplo, etanol) .

Pese a la ventaja de usar fitasas en estas aplicaciones, sorprendentemente pocas fitasas conocidas han obtenido aceptación generalizada en las industrias de alimento para animales, licuefacción de almidón y fermentación alcohólica. Los motivos de esto varían de una enzima a otra. Los problemas típicos se refieren a altos costes de fabricación y/o poca estabilidad/actividad de la enzima en el entorno de la aplicación deseada. Una fitasa debe cumplir diversos criterios enzimáticos si ha de ser atractiva para el uso generalizado en aplicaciones industriales. Los criterios enzimáticos más importantes incluyen una actividad específica global alta, un óptimo de pH bajo, resistencia a proteasas gastrointestinales y termoestabilidad

La termoestabilidad es uno de los requisitos previos más importantes para la aplicación satisfactoria de fitasa como enzima de alimento para animales y para su uso en procedimientos de licuefacción de almidón porque la fitasa en el alimento para animales y/o los procedimientos se exponen a temperaturas elevadas. Por ejemplo, en los procedimientos de preparación de gránulos de alimento para animales, las temperaturas son de entre 60 y 95º C y en procedimientos de licuefacción de almidón las temperaturas son de entre 75 y 120º C.

En el documento WO 06/043178, publicado el 27 de abril de 2006, se notificó la secuencia de ADN de un gen de Buttiauxella sp P1-29 que codifica para una fitasa. Se hace referencia a SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 y a la secuencia de aminoácidos del gen de fitasa de Buttiauxella sp P1-29 (SEQ ID NO: 3) notificadas en el mismo. Basándose en diversas propiedades intrínsecas, la fitasa de Buttiauxella sp P1-29 representaba un punto de partida excelente desde el que comenzar un programa de mutagénesis para lograr una fitasa termoestable para diversas aplicaciones comerciales. El documento WO 06/043178 da a conocer numerosas variantes de la fitasa de Buttiauxella sp P1-29 (véase por ejemplo la tabla 1) . Al menos una variante dada a conocer en el documento WO 06/043178 y designada en el presente documento BP-11 se ha modificado adicionalmente. En el presente documento se describen variantes que tienen propiedades alteradas, tales como propiedades mejoradas, incluyendo pero sin limitarse a a) termoestabilidad mejorada, b) actividad específica aumentada y/o c) actividad específica aumentada con retención de termoestabilidad en comparación con la fitasa de Buttiauxella sp P1-29 o la variante BP-11.

Sumario de la invención En un aspecto, la presente descripción se refiere a una fitasa que es el producto de expresión de una secuencia de ADN mutada que codifica para una fitasa, derivándose la secuencia de ADN mutada de un precursor de una fitasa de Buttiauxella spp. En una realización, la fitasa se deriva de Buttiauxella sp cepa P1-29.

En un aspecto adicional, la descripción se refiere a una variante de fitasa, comprendiendo dicha variante una sustitución que corresponde a las posiciones A122, D125, T167, F197, T209, A211, K240, A242, S281, Q289, A294 y N303 en una fitasa derivada de Buttiauxella sp cepa P1-29.

En el presente documento también se describe una fitasa aislada que comprende una sustitución que corresponde a las posiciones A122, D125, T167, F197, T209, A211, K240, A242, S281, Q289, A294 y N303 de SEQ ID NO: 1 y que tiene al menos una identidad de secuencia del 95% que incluye las sustituciones de variante con los residuos de aminoácido 34-446 de SEQ ID NO: 1. En una realización, la sustitución comprende A122T, D125A, T167I, F197S, T209K, A211P, K240E, A242S, S281L, Q289Y, A294E y N303K de SEQ ID NO: 1. En otra realización, la sustitución corresponde a las posiciones R51, R55, T58, K59, D125, R127, K164, N239, G248, T252, E255, E276, H286, F290, M293, N303, H339, D340, T341 y/o D361 de SEQ ID NO: 1.

En el presente documento también se describe una variante de la fitasa designada BP-11, comprendiendo dicha variante una sustitución que corresponde a las posiciones R24, R28, T31, K32, D98, R100, K137, N212, G221, T225, E228, E249, H259, F263, M266, N276, H312, D313, T314 y/o D334 de SEQ ID NO: 4. En una realización, la variante BP-11 tiene una sustitución en una posición que corresponde a D98. En una realización preferida, la sustitución es D98A.

La presente invención se refiere a un polipéptido que tiene actividad fitasa que comprende SEQ ID NO: 3 (figura 1C) y que tiene actividad específica aumentada. En una realización, la invención se refiere a un polipéptido que tiene actividad fitasa que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 (figura 1C) .

En un aspecto adicional, la invención se refiere a un ADN aislado que codifica para una variante de fitasa englobada por la invención y vectores de expresión que incluyen dicho ADN.

Aún en un aspecto adicional, la invención se refiere a una Buttiauxella sp. variante que tiene características de fitasa mejoradas. En una realización, la característica de fitasa mejorada será estabilidad térmica potenciada en comparación con BP-11.

En otros aspectos, la invención se refiere a composiciones enzimáticas que comprenden una proteína que tiene actividad fitasa en la que la composición enzimática se usa en aplicaciones comerciales. En una realización, la composición enzimática puede ser una composición de pienso. En otras realizaciones, la composición enzimática puede usarse en procedimientos de hidrólisis de almidón (por ejemplo, licuefacción) . En realizaciones adicionales, una composición enzimática que comprende una fitasa englobada por la invención incluirá enzimas adicionales, tales como glucoamilasas, alfa amilasas, proteasa, celulasas y combinaciones de las mismas.

En un aspecto, la presente invención se refiere a un medio de fermentación que incluye una variante de fitasa de Buttiauxella que comprende la secuencia mostrada... [Seguir leyendo]

1. Variante de fitasa aislada, comprendiendo dicha variante la secuencia mostrada en la figura 1C y que tiene actividad específica aumentada.

2. Variante de fitasa según la reivindicación 1, en la que la variante tiene estabilidad térmica aumentada, estabilidad proteolítica superior o actividad específica superior que la fitasa que tiene la secuencia de residuos de aminoácido 7-419 de la secuencia mostrada en la figura 1B.

3. ADN que codifica para una variante de fitasa según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

4. Vector de expresión que comprende el ADN según la reivindicación 3.

5. Célula huésped transformada con el vector de expresión según la reivindicación 4.

6. Composición enzimática que comprende una variante de fitasa según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2.

7. Composición enzimática según la reivindicación 6, en la que dicha composición es una composición de

pienso, una composición para su uso en un procedimiento de licuefacción de almidón o una composición para su uso en un procedimiento de fermentación alcohólica.

8. Composición enzimática según la reivindicación 7, que comprende además una enzima seleccionada del grupo de glucoamilasa, alfa amilasa, proteasas, celulasas, xilanasas y combinaciones de las mismas.

9. Medio de fermentación que comprende la variante de fitasa según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, producida a partir de un cultivo de células de hongo filamentoso.

10. Medio de fermentación según la reivindicación 9, en el que las células de hongo filamentoso son células de 30 Trichoderma tales como células de T. reesei.

11. Método para producir una variante de fitasa según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2 en una célula huésped, que comprende a) transformar una célula huésped con un constructo de ADN que incluye un promotor que tiene actividad transcripcional en la célula huésped operativamente unido a un polinucleótido heterólogo que codifica para una variante de fitasa según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2;

b) cultivar la célula huésped transformada en un medio de cultivo adecuado para permitir la expresión de 40 dicha fitasa y

c) producir la fitasa.

12. Método según la reivindicación 11:

(i) en el que la célula huésped es una célula fúngica, una célula bacteriana o una célula vegetal; o (ii) en el que la célula es una célula de levadura o una célula de hongo filamentoso; o 50 (iii) que comprende adicionalmente recuperar la fitasa producida; o (iv) en el que la célula huésped es una célula huésped de hongo filamentoso y la célula huésped de hongo filamentoso es una célula de Trichoderma;o 55 (v) en el que la célula de Trichoderma es una célula de T. reesei.