Fitasa de Hafnia.

Un polipéptido aislado que tiene actividad de fitasa, seleccionado del grupo que consiste en:

un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 85% identidad con los aminoácidos 1 a 413 de la SEQ ID NO: 10 sobre la longitud de aminoácidos 1 a 413 de la SEQ ID NO:10, donde la termoestabilidad relativa al polipéptido de aminoácidos 1 a 413 de la SEQ ID NO:10 es, o bien inafectada, o bien mejorada.

Fitasa de Hafnia Listado de secuencias [0001] La presente solicitud contiene una copia en papel y en formato digital de un listado de secuencias. Depósito de material biológico [0002] Una cepa bacteriana que produce fitasa fue aislada a partir de suelo danés. Se demostró que la cepa produce una fitasa con pH óptimo ácido y alta termoestabilidad. La cepa fue identificada como Hafnia alvei y fue depositada el 21 de Marzo de 2007, según las condiciones del Tratado de Budapest con el Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) y se le dio el siguiente número de acceso:

Depósito Número de acceso Fecha del depósito Hafnia alvei NN020125 DSM 19197 21 de Marzo de 2007

Campo de la invención [0003] La presente invención se refiere a polipéptidos aislados que tienen actividad de fitasa y polinucleótidos aislados que codifican los polipéptidos. Los polipéptidos están relacionados con una fitasa derivada de la Hafnia alvei, la secuencia de aminoácidos que se muestra en el listado de secuencias anexo como SEQ ID NO: 10. La invención también se refiere a constructos de ácidos nucleicos, vectores y células huésped que comprenden los polinucleótidos así como los métodos para producir y usar los polipéptidos, en particular en piensos para animales.

Antecedentes de la invención [0004] Las fitasas son enzimas bien conocidas, como lo son las ventajas de añadirlas a productos alimenticios para animales, incluyendo humanos. Las fitasas han sido aisladas a partir de muchas fuentes, incluyendo varias cepas fúngicas y bacterianas.

Específicamente WO 2006/043178 (DANISCO) divulga fitasas de una cepa de Buttiauxiella sp. y variantes de la misma. Estas fitasas son aproximadamente idénticas en un 70% a las fitasas de la presente invención.

Es un objetivo de la presente invención el proporcionar polipéptidos alternativos que tienen actividad de fitasa y polinucleótidos que codifican los polipéptidos. Los polipéptidos de la invención son preferiblemente de propiedades modificadas, más preferiblemente mejoradas, por ejemplo, de una especificidad de sustrato diferente, de una actividad específica más alta, de una estabilidad incrementada (como por ejemplo estabilidad ácida, estabilidad calorífica y/o estabilidad de proteasa, en particular estabilidad de pepsina) , de un pH óptimo alterado (por ejemplo un pH óptimo inferior o más alto) y/o de un rendimiento mejorado en piensos para animales (como por ejemplo una liberación y/o degradación de fitato mejorada) .

Resumen de la invención [0007] La presente invención se refiere a un polipéptido aislado con actividad de fitasa, seleccionado del grupo que consta de:

un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 85% de identidad con los aminoácidos 1 a 413 de la SEQ ID NO: 10 sobre la longitud de los aminoácidos 1 a 413 de la SEQ ID NO: 10, donde la termoestabilidad relativa al polipéptido de aminoácidos 1 a 413 de la SEQ ID NO: 10 es, o bien no afectada, o bien mejorada.

La invención también se refiere a polinucleótidos aislados que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de la invención.

La invención también se refiere a constructos de ácidos nucleicos que comprenden los polinucleótidos de la invención operativamente enlazados a una o más secuencias de control que dirigen la producción del polipéptido en un huésped de expresión, vectores de expresión recombinantes que comprenden el constructo de ácidos nucleicos de la invención y células huésped recombinantes que comprenden los constructos de ácidos nucleicos.

La invención se refiere también a métodos para producir tales polipéptidos de la invención que comprenden (a) cultivar una célula, que en su forma de tipo salvaje es capaz de producir el polipéptido o una célula huésped recombinante de la invención, bajo condiciones propicias para la producción del polipéptido; y (b) recuperar el polipéptido.

La invención se refiere adicionalmente a un método para la producción de un producto de fermentación, que comprende (a) fermentar un material que contiene carbohidratos en presencia de una fitasa de la invención usando un microorganismo fermentativo y (b) producir el producto de fermentación o el coproducto de fermentación del material fermentado que contiene carbohidratos, por el que el producto de fermentación es preferiblemente etanol, cerveza, vino o granos secos de destilería (GSD) .

La invención también se refiere a una planta transgénica, parte de la planta o célula vegetal, que ha sido transformada con un polinucleótido que codifica el polipéptido de la invención.

Adicionalmente la invención se refiere a un aditivo para pienso que comprende

(a) al menos un polipéptido de la invención; y

(b) al menos una vitamina soluble en grasa, al menos una vitamina hidrosoluble, al menos un oligoelemento o combinaciones de los mismos.

Según la invención, tal aditivo de pienso puede además comprender al menos una amilasa, al menos una fitasa adicional, al menos una xilanasa, al menos una galactanasa, al menos una alfa-galactosidasa, al menos una proteasa, al menos una fosfolipasa y/o al menos una beta-glucanasa.

La invención se refiere adicionalmente a una composición de pienso para animales con un contenido bruto de proteína de 50 a 800 g/kg y que comprende al menos un polipéptido de la invención y el uso de al menos un polipéptido de la invención en pienso para animales o en la preparación de una composición para uso en pienso para animales.

Breve descripción de las figuras

Fig. 1 muestra el fósforo residual unido al inositol-fosfato después de incubación in vitro, en una comparación entre la fitasa de Hafnia alvei y una fitasa de Citrobacter braakii dosificada desde 125 hasta 500 FYT/kg de pienso.

Fig. 2 muestra una comparación del fósforo residual enlazado al inositol-fosfato después de incubación in vitro entre la fitasa de Hafnia alvei y una fitasa Peniophora lycii dosificada a 250 FYT/kg de pienso y a 500 FYT/kg de pienso.

Fig. 3 muestra el Apéndice de las coordenadas estructurales para la estructura tridimensional cristalina resuelta de la fitasa de Hafnia alvei.

Definiciones [0017] Actividad de fitasa: en el presente contexto, un polipéptido con actividad de fitasa (una fitasa) es una enzima que cataliza la hidrólisis de fitato (myo-inositol hexakisfosfato) a (1) myo-inositol y/o (2) mono-, di-, tri-, tetra y/o pentafosfatos del mismo y (3) fosfato inorgánico.

El sitio ENZYMA en Internet (www.expasy.ch/enzyme/) es un repositorio de información relativo a la nomenclatura de enzimas. Está principalmente basado en las recomendaciones del Comité de Nomenclatura de la Unión Internacional de Bioquímica y Biología Molecular (IUB-MB) y describe cada tipo de enzima caracterizada para la cual un número EC (Comisión Enzimática) ha sido proporcionado (Bairoch A. The ENZYME database, 2000, Nucleic Acid Res 28:304-305) . Ver también el manual de Nomenclatura Enzimática de NC-IUBMB, 1992.

Según el sitio ENZYMA, se conocen tres tipos diferentes de fitasas: una 3-fitasa (myo-inositol hexafosfato 3fosfohidrolasa, EC 3.1.3.8) , una 6-fitasa (myo-inositol hexafosfato 6-fosfohidrolasa, EC 3.1.3.26) y una 5-fitasa (EC 3.1.3.72) . A efectos de la presente invención, todos los tipos se incluyen en la definición de fitasa.

En una realización particular, las fitasas de la invención pertenecen a la familia de las fosfatasas de histidina ácida, que incluyen la fosfatasa ácida de Escherichia coli con pH 2.5 (gen appA) así como fitasas fúngicas tales como las fitasas de Aspergillus awamorii A y B (EC: 3.1.3.8) (genes PhyA y phyB) . Las fosfatasas de ácido de histidina comparten dos regiones de similitud de la secuencia, cada una centrada alrededor de un residuo de histidina conservado. Estas dos histidinas parecen estar implicadas en el mecanismo catalítico de las enzimas. La primera histidina se sitúa en la sección N-terminal y forma un intermedio de fosfo-histidina mientras que la segunda se localiza en la sección C-terminal y posiblemente actúa como donante de protones.

En una forma de realización particular adicional, las fitasas de la invención tienen un motivo conservado de sitio activo, esto es, R-H-G-X-R-X-P, donde X designa cualquier aminoácido (ver aminoácidos 18 a 24 de la fitasa madura mostrados en la SEQ ID NO: 10) .

A efectos de la presente invención la actividad de fitasa se determina en unidades FYT, siendo una FYT la cantidad de enzima que libera 1 micro-mol de ortofosfato inorgánico por minuto bajo las siguientes condiciones: pH 5.5;

temperatura 37°C; sustrato: fitato... [Seguir leyendo]

1. Un polipéptido aislado que tiene actividad de fitasa, seleccionado del grupo que consiste en:

un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 85% identidad con los aminoácidos 1 a 413 de la SEQ ID NO: 10 sobre la longitud de aminoácidos 1 a 413 de la SEQ ID NO:10, donde la termoestabilidad relativa al polipéptido de aminoácidos 1 a 413 de la SEQ ID NO:10 es, o bien inafectada, o bien mejorada.

2. Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido según la reivindicación 1.

3. Un constructo de ácidos nucleicos que comprende el polinucleótido según la reivindicación 2 operativamente 15 enlazado a una o más secuencias de control que dirigen la producción del polipéptido en un huésped de expresión.

4. Un vector de expresión recombinante que comprende el constructo de ácidos nucleicos según la reivindicación 3.

5. Una célula huésped recombinante que comprende el constructo de ácidos nucleicos según la reivindicación 3. 20

6. Una planta transgénica, parte de planta o célula vegetal, que comprende el constructo de ácidos nucleicos según la reivindicación 3.

7. Un aditivo de pienso que comprende 25 (a) al menos un polipéptido según la reivindicación 1; y

(b) al menos una vitamina liposoluble, al menos una vitamina hidrosoluble, al menos un oligoelemento o combinaciones de los mismos.

8. Aditivo de pienso según la reivindicación 7, que además comprende al menos una amilasa, al menos una fitasa adicional, al menos una xilanasa, al menos una galactanasa, al menos una alfa-galactosidasa, al menos una proteasa, al menos una fosfolipasa y/o al menos una beta-glucanasa.

9. Una composición de pienso para animales con un contenido bruto de proteína de 50 a 800 g/kg y que comprende al

menos un polipéptido según la reivindicación 1. 35

10. Un método para la producción del polipéptido según la reivindicación 1, comprendiendo el método (a) cultivar una célula, que en su forma de tipo salvaje es capaz de producir el polipéptido o una célula huésped recombinante según la reivindicación 5, bajo condiciones propicias para la producción del polipéptido; y (b) recuperar el polipéptido.

11. Un método para la producción de un producto de fermentación, que comprende (a) fermentar un carbohidrato que contiene material en presencia de una fitasa según la reivindicación 1 usando un microorganismo fermentativo y (b) producir el producto de fermentación o el coproducto de fermentación del material fermentado que contiene carbohidratos, por el que el producto de fermentación es preferiblemente etanol, cerveza, vino o granos secos de destilería (GSD) .

12. Uso de al menos un polipéptido según la reivindicación 1 en pienso para animales o en la preparación de una composición para uso en piensos para animales.