Filtración hidrófila durante la fabricación de adyuvantes para vacunas.

Método para fabricar un adyuvante para vacunas en emulsión de aceite en agua que contiene escualeno,

que comprende las etapas de:

(i) formar una primera emulsión con un tamaño medio de gotitas de aceite de 5.000 nm o menor;

(ii) microfluidificar la primera emulsión para formar una segunda emulsión con un tamaño medio de gotitas de aceite de 500 nm o menor; y

(iii) filtrar la segunda emulsión utilizando una membrana asimétrica hidrófila, proporcionando así un adyuvante para vacunas.

CAMPO TÉCNICO

La presente invención se encuentra en el campo de la fabricación de adyuvantes para vacunas en emulsión de aceite en agua, por ejemplo mediante microfluidificación.

ANTECEDENTES DE LA TÉCNICA

El adyuvante para vacunas conocido como “MF59” [1-3] es una emulsión submicrométrica de aceite en agua de escualeno, polisorbato 80 (también conocido como Tween 80) y trioleato de sorbitán (también conocido como Span 85) . También puede incluir iones citrato, por ejemplo tampón de citrato de sodio 10 mM. La composición de la emulsión en volumen puede ser escualeno aproximadamente al 5%, Tween 80 aproximadamente al 0, 5% y Span 85 aproximadamente al 0, 5%. El adyuvante y su producción se describen con más detalle en el capítulo 10 de la referencia 4, en el capítulo 12 de la referencia 5 y en el capítulo 19 de la referencia 6.

Como se describe en la referencia 7, MF59 se fabrica a escala comercial dispersando Span 85 en la fase de escualeno y Tween 80 en la fase acuosa, seguido de mezcla a alta velocidad para formar una emulsión grosera. A continuación, se hace pasar varias veces esta emulsión grosera por un microfluidificador para producir una emulsión con un tamaño de gotitas de aceite uniforme. Como se describe en la referencia 6, a continuación se filtra la emulsión microfluidificada a través de una membrana de 0, 22 μm con el fin de eliminar cualquier gotita de aceite grande, y el tamaño medio de las gotitas de la emulsión resultante permanece inalterada durante al menos 3 años a 4ºC. Puede medirse el contenido de escualeno de la emulsión final como se describe en la referencia 8.

En diversos documentos (por ejemplo, las referencias 9-12) se describe que MF59 puede fabricarse mediante microfluidificación seguida de esterilización por filtración a través de un filtro de polisulfona de 0, 22 μm. Las polisulfonas son polímeros que contienen grupos sulfona (SO2) en la cadena principal del polímero y los filtros de polisulfona son filtros hidrófobos bien conocidos.

Es un objeto de la invención proporcionar métodos adicionales y mejorados para la producción de emulsiones de aceite en agua microfluidificadas (tales como MF59) , en concreto métodos que sean adecuados para su uso a escala comercial y que utilicen la filtración.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La invención también proporciona un método para fabricar una emulsión de aceite en agua que comprende las etapas de: (i) preparar una primera emulsión con un primer tamaño medio de gotitas de aceite de 5.000 nm o menor, también conocida como emulsión preliminar o pre-emulsión; (ii) microfluidificar la primera emulsión para formar una segunda emulsión con un segundo tamaño medio de gotitas de aceite que es inferior al primer tamaño medio de gotitas de aceite, y (iii) filtrar la segunda emulsión utilizando una membrana asimétrica hidrófila.

Opcionalmente, puede prepararse la primera emulsión utilizando un homogeneizador como se describe más adelante.

Como se describe con más detalle más adelante, la primera emulsión puede tener un tamaño medio de gotitas de aceite de 5.000 nm o menor, por ejemplo, un tamaño medio entre 300 nm y 800 nm. El número de gotitas de aceite en la primera emulsión con un tamaño > 1, 2 μm puede ser 5 x 1011 /ml o menor, como se describe más adelante. Las gotitas de aceite con un tamaño > 1, 2 μm resultan desventajosas, ya que pueden provocar inestabilidad de la emulsión debido a la aglomeración y a la coalescencia de las gotitas [14].

Después de su formación, a continuación puede someterse la primera emulsión a al menos un pase de microfluidificación para formar la segunda emulsión con un tamaño medio de gotitas de aceite reducido. Como se describe más adelante, el tamaño medio de las gotitas de aceite de la segunda emulsión es 500 nm o menor. El número de gotitas de aceite en la segunda emulsión con un tamaño > 1, 2 μm puede ser 5 x 1010 /ml o menor, como se describe más adelante. Para conseguir estas características puede ser necesario hacer pasar los componentes de la emulsión por el dispositivo de microfluidificación varias veces, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7 veces.

La segunda emulsión se filtra a través de una membrana asimétrica hidrófila, por ejemplo una membrana de polietersulfona hidrófila, para proporcionar una emulsión de aceite en agua que pueda ser adecuada para su uso como adyuvante para vacunas. El tamaño medio de las gotitas de aceite de la emulsión de aceite en agua producida después de la filtración puede ser 220 nm o menor, por ejemplo entre 135 nm-175 nm, entre 145 nm-165 nm o aproximadamente 155 nm. El número de gotitas de aceite con un tamaño > 1, 2 μm presentes en la emulsión de aceite en agua producida después de la filtración puede ser 5 x 108 /ml o menor, por ejemplo 5 x 107 /ml o menor, 5x 106 /ml o menor, 2 x 106 /ml o menor ó 5 x 105 /ml o menor.

La emulsión final de aceite en agua formada después de la filtración puede tener al menos 102 veces menos gotitas de aceite con un tamaño > 1, 2 μm en comparación con la primera emulsión, e idealmente al menos 103 veces menos (por ejemplo, 104 veces menos) .

En algunas formas de realización, se utiliza más de un ciclo de las etapas (i) y (ii) antes de la etapa (iii) . Del mismo modo, pueden utilizarse múltiples repeticiones de las etapas individuales (i) y (ii) .

Del mismo modo, la invención proporciona el uso de una membrana asimétrica hidrófila para preparar un adyuvante en emulsión de aceite en agua. Más adelante se analizan otras características de la membrana y del adyuvante en emulsión.

En general, los métodos de la invención se llevan a cabo entre 20ºC-60ºC, e idealmente a 40±5ºC. Aunque los componentes de la emulsión primero y segundo pueden ser relativamente estables incluso a temperaturas más elevadas, todavía puede producirse la degradación térmica de algunos componentes, por lo que resultan preferentes temperaturas más bajas.

Componentes de la emulsión El tamaño medio de las gotitas de aceite (es decir, el diámetro medio en número de las gotitas de aceite de la emulsión) puede medirse utilizando una técnica de dispersión de luz dinámica, como se describe en la referencia 13. Un ejemplo de una máquina de medición de dispersión de luz dinámica es el analizador de tamaño de partículas submicrométricas Nicomp 380 (de Particle Sizing Systems) .

Puede medirse el número de partículas con un tamaño > 1, 2 μm utilizando un contador de partículas tal como el Accusizer™ 770 (de Particle Sizing Systems) .

Los métodos de la invención se utilizan para fabricar emulsiones de aceite en agua. Estas emulsiones incluyen tres ingredientes básicos: un aceite, un componente acuoso y un tensioactivo.

Dado que las emulsiones están destinadas al uso farmacéutico, el aceite será por lo general biodegradable (metabolizable) y biocompatible.

El aceite utilizado puede comprender escualeno, un aceite de hígado de tiburón que es un terpenoide insaturado ramificado (C30H50; [ (CH3) 2C[=CHCH2CH2C (CH3) ]2=CHCH2-]2; 2, 6, 10, 15, 19, 23-hexametil-2, 6, 10, 14, 18, 22tetracosahexaeno, CAS RN 7683-64-9) . El escualeno resulta especialmente preferente para su uso en la presente invención.

El aceite de la presente invención puede comprender una mezcla (o combinación) de aceites, por ejemplo, que comprenda escualeno y al menos un aceite adicional.

En vez de (o además de) utilizar escualeno, una emulsión puede comprender otro (s) aceite (s) , incluidos, por ejemplo, los de una fuente vegetal o animal (como el pescado) . Las fuentes de aceites vegetales incluyen frutos secos, semillas y granos. Son ejemplos de aceites de frutos secos el aceite de cacahuete, el aceite de soja, el aceite de coco y el aceite de oliva, los más comúnmente disponibles. Puede utilizarse el aceite de jojoba, por ejemplo, obtenido de la semilla de jojoba. Los aceites de semillas incluyen aceite de cártamo, aceite de semilla de algodón, aceite de semilla de girasol, aceite de semilla de sésamo y similares. En el grupo de los granos, el aceite de maíz es el de más fácil adquisición, pero también puede utilizarse el aceite de otros granos de cereales tales como trigo, avena, centeno, arroz, tef, tritical y similares. Los ésteres de ácidos grasos de 6 a 10 carbonos de glicerol y 1, 2-propanodiol, a pesar de no encontrarse de forma natural en los aceites de semillas, pueden prepararse mediante hidrólisis, separación y esterificación de los materiales apropiados a partir de aceites de frutos secos y semillas. Las grasas y aceites de la leche de los mamíferos son metabolizables y por tanto pueden utilizarse.... [Seguir leyendo]

1. Método para fabricar un adyuvante para vacunas en emulsión de aceite en agua que contiene escualeno, que comprende las etapas de:

(i) formar una primera emulsión con un tamaño medio de gotitas de aceite de 5.000 nm o menor;

(ii) microfluidificar la primera emulsión para formar una segunda emulsión con un tamaño medio de gotitas de aceite de 500 nm o menor; y

(iii) filtrar la segunda emulsión utilizando una membrana asimétrica hidrófila, proporcionando así un adyuvante para vacunas.

2. Método según la reivindicación 1, en el que la membrana hidrófila es una membrana de polietersulfona hidrófila.

3. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el número de gotitas de aceite con un tamaño de > 1, 2 μm en la primera emulsión es 5 x 1011 /ml o menor, en una forma de realización 5 x 1010 /ml o menor, en una forma de realización 5 x 108 /ml o menor.

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el tamaño medio de las gotitas de aceite después de la filtración es inferior a 220 nm.

5. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la segunda emulsión se prefiltra a través de una membrana antes de la filtración.

6. Método según la reivindicación 5, en el que las etapas de prefiltración y de filtración se llevan a cabo utilizando un filtro de doble capa.

7. Método según la reivindicación 5 o la reivindicación 6, en el que la membrana de prefiltración es asimétrica y/o porosa.

8. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la membrana de filtración es porosa.

9. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la membrana de filtración y, opcionalmente, la membrana de prefiltración, comprende un material de soporte polimérico.

10. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que (i) la primera capa tiene un tamaño de poro > 0, 3 μm, y/o (ii) la segunda capa tiene un tamaño de poro < 0, 3 μm.

11. Método para preparar una composición de vacuna, que comprende preparar un adyuvante en emulsión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 y combinar el adyuvante en emulsión con un antígeno.

12. Método para preparar un kit de vacuna que comprende preparar un adyuvante en emulsión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 y envasar el adyuvante en emulsión en un kit como un componente de kit junto con un componente antígeno.

13. Método según la reivindicación 12, en el que los componentes de kit se encuentran en viales separados.

14. Método según la reivindicación 13, en el que los viales están hechos de vidrio de borosilicato.

15. Método según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, en el que el adyuvante en emulsión es un adyuvante a granel y el método comprende extraer dosis unitarias a partir del adyuvante a granel para el envasado como componentes de kit.

16. Método según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 15, en el que el antígeno es un antígeno del virus de la gripe.

17. Método según la reivindicación 16, en el que la combinación de la emulsión y el antígeno forma una composición de vacuna y en el que la composición de vacuna incluye aproximadamente 15 μg, aproximadamente 10 μg, aproximadamente 7, 5 μg, aproximadamente 5 μg, aproximadamente 3, 8 μg, aproximadamente 3, 75 μg, aproximadamente 1, 9 μg o aproximadamente 1, 5 μg de hemaglutinina por cepa de virus de la gripe.

18. Método según la reivindicación 16 o la reivindicación 17, en el que la combinación de la emulsión y el antígeno forma una composición de vacuna y en el que la composición de vacuna incluye un conservante de tiomersal o 2-fenoxietanol.