Derivados estables de NAD/NADH.

Elemento de ensayo para la determinación de un analito, que comprende (i) una enzima dependiente de coenzima o un sustrato para una enzima de este tipo y (ii) como coenzima un compuesto con la siguiente fórmula general (I):

**Fórmula**

con

A ≥ adenina o un análogo de la misma,

T ≥ en cada caso independientemente O, S,

U ≥ en cada caso independientemente OH, SH, BH3 -, BCNH2 -,

V ≥ en cada caso independientemente OH o un grupo fosfato, donde, en el caso de que un resto V sea un grupo OH y el segundo resto V sea un grupo fosfato, el grupo OH y el grupo fosfato, con los átomos de carbono a los que están unidos, pueden formar un ciclo,

W ≥ COOR, CON(R)2, COR, CSN(R)2 con R ≥ en cada caso independientemente H o alquilo C1-C2,

X1, X2 ≥ en cada caso independientemente O, CH2, CHCH3, C(CH3)2, NH, NCH3,

Y ≥ NH, S, O, CH2,

Z ≥ un resto que comprende un grupo cíclico con 5 átomos de C, que contiene dado el caso un heteroátomo seleccionado de O, S y N así como dado el caso uno o varios sustituyentes y

un resto CR42, estando CR42 unido al grupo cíclico y a X2, con

R4 ≥ en cada caso independientemente H, F, Cl, CH3,

con la condición de que Z y el resto piridina no estén enlazados a través de un enlace glucosídico,

o una sal o dado el caso una forma reducida del mismo,

caracterizado por que

está configurado como ensayo en seco.

Derivados estables de NAD/NADH

La invención se refiere a elementos de ensayo que comprenden derivados estables de dinucleótido de nicotinamida y adenina (NAD/NADH) o de fosfato de dinucleótido de nicotinamida y adenina (NADP/NADPH) y a su uso en procedimientos bioquímicos de detección.

Los sistemas de medición para la analítica bioquímica son constituyentes importantes de procedimientos de análisis clínicamente relevantes. En este sentido tiene prioridad la medición de analitos, por ejemplo metabolitos o sustratos, que se determinan directa o indirectamente con ayuda de una enzima. Los analitos se hacen reaccionar a este respecto con ayuda de un complejo de enzima-coenzima y, a continuación, se cuantifican. A este respecto, el analito que va a determinarse se pone en contacto con una enzima y una coenzima adecuadas, utilizándose la enzima, en la mayoría de los casos, en cantidades catalíticas. La coenzima se cambia mediante la reacción enzimática, por

ejemplo se oxida o se reduce. Este proceso puede detectarse de manera electroquímica o fotométrica directamente o a través de un mediador. Una calibración proporciona una relación directa del valor de medición con la concentración del analito que va a determinarse.

Las coenzimas son moléculas orgánicas que están unidas de manera covalente o no covalente a una enzima y que cambian mediante la reacción del analito. Son ejemplos destacados de coenzimas dinucleótido de nicotinamida y adenina (NAD) o fosfato de dinucleótido de nicotinamida y adenina (NADP) , a partir de los cuales, mediante reducción, se genera NADH o NADPH.

Los sistemas de medición conocidos por el estado de la técnica se caracterizan por una durabilidad de tiempo limitado así como por requisitos especiales en cuanto al entorno, tales como refrigeración o almacenamiento en seco, para conseguir esta durabilidad. En determinadas formas de aplicación, por ejemplo en ensayos que se llevan a cabo por el propio consumidor final, tal como, por ejemplo, en la automonitorización de la glucemia, pueden aparecer, por tanto, resultados erróneos debido a un almacenamiento erróneo inadvertido y equivocado. Especialmente el agotamiento de desecantes debido a un tiempo de apertura demasiado largo de los envases primarios puede llevar a mediciones erróneas que, en algunos sistemas, el consumidor apenas puede reconocer.

Una medida conocida que se utiliza para aumentar la estabilidad de sistemas de medición bioquímicos es el uso de enzimas estables, por ejemplo el uso de enzimas de organismos termófilos. Existe además la posibilidad de estabilizar enzimas mediante modificación química, por ejemplo reticulación, o mediante mutagénesis. Además pueden añadirse también estabilizantes de enzima, tales como, por ejemplo, trehalosa, polivinilpirrolidona y albúmina sérica, o las enzimas pueden incluirse, por ejemplo, mediante fotopolimerización en redes poliméricas.

Además se intenta mejorar la durabilidad de sistemas de medición bioquímicos mediante el uso de mediadores estables. De este modo, mediante el uso de mediadores con un potencial redox lo más bajo posible, se aumenta la especificidad de los ensayos y se eliminan perturbaciones durante la reacción. Un límite inferior para el potencial redox de mediadores lo forman, sin embargo, los potenciales redox de los complejos enzima/coenzima. Si se cae por debajo de los mismos, la reacción con los mediadores se ralentiza o incluso se impide.

Como alternativa pueden usarse también sistemas de medición bioquímicos sin mediadores, en los que, por

ejemplo, se realiza una detección directa de coenzimas, por ejemplo de la coenzima NADH. Sin embargo, una desventaja de tales sistemas de medición consiste en que las coenzimas, tales como NAD y NADP, son inestables.

El NAD y NADP son moléculas lábiles frente a bases, cuyas rutas de degradación están descritas en la bibliografía (N. J. Oppenheimer en The Piridine Nucleotide Coenzyms Academic Press Nueva York, Londres 1982, ed. J.

Everese, B. Anderson, K. You, capítulo 3, páginas 56-65) . En esencial, durante la degradación de NAD o NADP se genera ADP-ribosa al escindirse los enlaces glucosídicos entre la ribosa y la unidad de piridina. Las formas reducidas NADH y NADPH son, por el contrario, lábiles frente a ácidos: por ejemplo, la epimerización es una ruta de degradación conocida. En ambos casos, la inestabilidad de NAD/NADP y NADH/NADPH se basa en la labilidad del enlace glucosídico entre la unidad de ribosa y la de piridina: pero incluso también en condiciones no drásticas, tales 55 como, por ejemplo, en solución acuosa, se produce la hidrólisis de las coenzimas NAD o NADP, tan solo por la humedad ambiental. Esta inestabilidad puede llevar a imprecisiones en la medición de analitos.

Una serie de derivados de NAD/NADP se describe, por ejemplo, en B. M. Anderson en the Piridine Nucleotide Coenzimes, Academic Press Nueva York, Londres 1982, ed. J. Everese, B. Anderson, K. You, capítulo 4. No 60 obstante, la mayoría de estos derivados no son aceptados adecuadamente por las enzimas. Por lo tanto, el único derivado que se ha usado hasta el momento para ensayos de diagnóstico es el dinucleótido de 3-acetilpiridina adenina (acetil NAD) , que se describió por primera vez en 1956 (N. O. Kaplan, J. Biol. Chem. (1956) , 221, 823) . También esta coenzima muestra una baja aceptación por las enzimas y una variación en el potencial redox.

En el documento WO 01/94370 se describe el uso de otros derivados de NAD con un grupo piridina modificado. Las modificaciones del grupo nicotinamida tienen, sin embargo, en general una influencia directa sobre la reacción catalítica. En la mayoría de los casos, esta influencia es negativa.

En otro concepto de estabilización se cambió la unidad de ribosa para influir de esta manera en la estabilidad del enlace glucosídico. Este modo de proceder no interfiere directamente con la reacción catalítica del grupo nicotinamida. Sin embargo, puede existir una influencia indirecta tan pronto como la enzima presente un enlace fuerte y específico a la unidad de ribosa. A este respecto, Kaufmann y col. dan a conocer en los documentos WO 98/33936 y US 5.801.006 o en el documento WO 01/49247 una serie de derivados de tiorribosa NAD. Sin embargo,

hasta el momento no se ha demostrado una relación entre la modificación de la unidad de nicotinamida-ribosa y la actividad de los derivados en reacciones enzimáticas.

CarbaNAD, un derivado sin enlace glucosídico, se describió por primera vez en 1988 (J. T. Slama, Biochemistr y 1989, 27, 183 y Biochemistr y 1989, 28, 7688) . La ribosa se sustituye aquí por una unidad de azúcar carbacíclica. Si bien carbaNAD se describió como sustrato para deshidrogenasas, su actividad no se ha detectado hasta el momento en procedimientos bioquímicos de detección en la práctica clínica.

Un planteamiento similar se describió posteriormente por G. M. Blackburn, Chem. Comm., 1996, 2765, para preparar carbaNAD con un compuesto de metilenbisfosfonato en lugar del pirofosfato natural. El metilenbisfosfonato muestra una estabilidad aumentada frente a fosfatasas y se ha usado como inhibidor para ADP-ribosilciclasa. Un aumento de la estabilidad frente a la hidrólisis no era el objetivo (J. T. Slama, G. M. Blackburn) .

Por lo tanto, la presente invención se basa en el objetivo de proporcionar sistemas de medición bioanalíticos, estables, en particular para la determinación de glucosa, que eviten la sensibilidad a la hidrólisis de NAD/NADP y

que, al mismo tiempo, sean activos como coenzimas en reacciones enzimáticas.

Este objetivo se resuelve mediante un elemento de ensayo para la determinación de un analito, que comprende (i) una enzima dependiente de coenzima o un sustrato para una enzima de este tipo y (ii) como coenzima un compuesto con la siguiente fórmula general (I) :

con A = adenina o un análogo de la misma,

T = en cada caso independientemente O, S, U = en cada caso independientemente OH, SH, BH3-, BCNH2-, V = en cada caso independientemente OH o un grupo fosfato, tal como se define en la reivindicación 1, W = COOR, CON (R) 2, COR, CSN (R) 2 con R = en cada caso independientemente H o alquilo C1-C2, X1, X2 = en cada caso independientemente O, CH2, CHCH3, C (CH3) 2, NH, NCH3,

Y = NH, S, O, CH2,

Z = un resto que comprende un grupo cíclico con 5 átomos de C, que contiene dado el caso un heteroátomo seleccionado de O, S y N así como dado el caso uno o varios sustituyentes, y un resto CR42, estando CR42 unido al grupo cíclico y a X2, con R4 = en cada caso independientemente H, F, Cl, CH3,

con la condición de que Z y el resto piridina no estén enlazados a través de... [Seguir leyendo]

1. Elemento de ensayo para la determinación de un analito, que comprende (i) una enzima dependiente de coenzima o un sustrato para una enzima de este tipo y (ii) como coenzima un compuesto con la siguiente fórmula general (I) :

con 10

A = adenina o un análogo de la misma,

T = en cada caso independientemente O, S,

U = en cada caso independientemente OH, SH, BH3-, BCNH2-,

V = en cada caso independientemente OH o un grupo fosfato, donde, en el caso de que un resto V sea un grupo 15 OH y el segundo resto V sea un grupo fosfato, el grupo OH y el grupo fosfato, con los átomos de carbono a los que están unidos, pueden formar un ciclo,

W = COOR, CON (R) 2, COR, CSN (R) 2 con R = en cada caso independientemente H o alquilo C1-C2,

X1, X2 = en cada caso independientemente O, CH2, CHCH3, C (CH3) 2, NH, NCH3,

Y = NH, S, O, CH2, 20 Z = un resto que comprende un grupo cíclico con 5 átomos de C, que contiene dado el caso un heteroátomo seleccionado de O, S y N así como dado el caso uno o varios sustituyentes y

un resto CR42, estando CR42 unido al grupo cíclico y a X2, con R4 = en cada caso independientemente H, F, Cl, CH3, 25 con la condición de que Z y el resto piridina no estén enlazados a través de un enlace glucosídico,

o una sal o dado el caso una forma reducida del mismo, caracterizado por que está configurado como ensayo en seco.

2. Elemento de ensayo de acuerdo con la reivindicación 1 para la determinación de glucosa, que comprende una glucosa deshidrogenasa y, como coenzima, un compuesto de acuerdo con la fórmula general (I) o una sal del mismo.

3. Elemento de ensayo de acuerdo con la reivindicación 1 o 2,

caracterizado por que los sustituyentes en Z están seleccionados del grupo F, Cl así como alquilo C1-C2, dado el caso fluorado o clorado y/o sustituido con OH, O-alquilo C1-C2.

4. Elemento de ensayo de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende como coenzima un 40 compuesto con la siguiente fórmula general (I') :

con A = adenina o un análogo de la misma, T = en cada caso independientemente O, S, U = en cada caso independientemente OH, SH, BH3-, BCNH2-, V = en cada caso independientemente OH o un grupo fosfato, W = COOR, CON (R) 2, COR, CSN (R) 2 con R = en cada caso independientemente H o alquilo C1-C2, X1, X2 = en cada caso independientemente O, CH2, CHCH3, C (CH3) 2, NH, NCH3, Y = NH, S, O, CH2, Z = un anillo de cinco miembros carbocíclico o heterocíclico, saturado o insaturado, de fórmula general (II)

pudiendo existir entre R5' y R5'' un enlace simple o doble, con R4 = en cada caso independientemente H, F, Cl, CH3, R5 = CR42,

cuando entre R5' y R5'' existe un enlace simple, R5' = O, S, NH, N-alquilo C1-C2, CR42, CHOH, CHOCH3, R5'' = CR42, CHOH, CHOCH3, cuando entre R5' y R5'' existe un doble enlace, R5'=R5''= CR4,

R6, R6' = en cada caso independientemente CH, CCH3,

o una sal o dado el caso una forma reducida del mismo.

5. Elemento de ensayo de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 4 con 25 W = CONH2 o COCH3.

6. Elemento de ensayo de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 5 en forma de una tira de ensayo.

7. Elemento de ensayo de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 6,

caracterizado por que la enzima es una deshidrogenasa, seleccionada de una glucosa deshidrogenasa (E.C.1.1.1.47) , lactato deshidrogenasa (E.C.1.1.1.27, 1.1.1.28) , malato deshidrogenasa (E.C.1.1.1.37) , glicerol deshidrogenasa (E.C. 1.1.1.6) , alcohol deshidrogenasa (E.C.1.1.1.1) , alfa-hidroxibutirato deshidrogenasa, sorbitol deshidrogenasa o aminoácido deshidrogenasa, tal como, por ejemplo, L-aminoácido deshidrogenasa (E.C.1.4.1.5) .

8. Elemento de ensayo de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 7 para la detección de glucosa, caracterizado por que la enzima es glucosa deshidrogenasa.

9. Uso del elemento de ensayo de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 8 para la determinación de analitos seleccionados de glucosa, ácido láctico, ácido málico, glicerol, alcohol, colesterol, triglicéridos, ácido ascórbico, cisteína, glutatión, péptidos, urea, amonio, salicilato, piruvato.

5. nucleotidasa, creatina cinasa (CK) , lactato deshidrogenasa (LDH) y dióxido de carbono.

10. Procedimiento para la detección de un analito, que comprende las etapas (a) poner en contacto una muestra con un elemento de ensayo de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 8, que comprende una coenzima y

(b) detectar el analito. 50

11. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 10, caracterizado por que la detección del analito se realiza mediante fotometría o fluorometría.

12. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 10 u 11, caracterizado por que la muestra es un líquido corporal, aguas residuales o un alimento.