Compuestos insecticidas y métodos para la selección de los mismos.

Un polipéptido aislado con una actividad insecticida de secuencia SEQ ID NO:2.

Compuestos insecticidas y métodos para la selección de los mismos

1. Campo de la invención

[1] La presente invención hace referencia a compuestos biológicos, así como a genes que codifican compuestos biológicos, para su uso como pesticidas, así como a métodos para obtener dichos compuestos.

2. Antecedentes de la técnica relacionada

[2] Por desgracia, se ha visto cada vez más en las últimas décadas que el empleo de insecticidas químicos convencionales suele provocar consecuencias medioambientales no deseadas. Dichas consecuencias incluyen la toxicidad de organismos que no eran el objetivo como pájaros y peces y peligros para la salud de los humanos. Además

[3] A lo largo de los últimos años, se han propuesto una cantidad de estrategias "respetuosas con el medio ambiente" para combatir las plagas de insectos fuertemente resistentes como algunas especies de gusano del algodón (p.ej., Helicoverpa zea).

[4] Una propuesta recientemente introducida para enfrentarse los insectos consiste en la producción de cultivos transgénicos que expresan toxinas insecticidas, como las cosechas de algodón y patata genéticamente modificadas que expresan toxinas de proteína a partir de la bacteria de tierra Bacillus thuringiensis (Estruch, J.J. et. al., Transgenic plants: An emerging approach to pest control, Nature Biotechnology 15, 137-141, 1997).

[5] Una variación de esta estrategia es la liberación de algunos virus específicos de insecto que han sido genéticamente modificados para expresar neurotoxinas insecticidas (Cory, J.S. et al., Field tríal of a genetically improved baculovirus insecticide, Nature 37, 138-14, 1994). Los baculovirus, por ejemplo, son virus específicos de artrópodos y ningún miembro de la familia de baculovirus es conocido por infectar ni a vertebrados ni a plantas. La capacidad de infección de algunos baculovirus se limita a unas pocas especies relacionadas dentro de una única familia de insectos lepidópteros (polillas y mariposas) (véase, p.ej., la patente estadounidense núm. 5,639,454). Algunos baculovirus, como el virus de la poliedrosis nuclear de la gardama, sólo afecta a una única especie. Como resultado de su alto nivel de especificidad, los baculovirus se han concebido desde hace tiempo como potenciales agentes de control de plagas y se utilizaron primero como tales en los años 7. Su especificidad significa que los insecticidas baculovirales complementan a los predadores naturales, en lugar de reemplazarlos, como es el caso de muchos insecticidas químicos. Sin embargo, hasta la fecha, los baculovirus se han encontrado solo con un éxito comercial limitado. La mayoría de los baculovirus que ocurren de manera natural tardan entre 4 y 7 días en matar a sus anfitriones e incluso con algunas especies tardan mucho más. Durante este tiempo el insecto continúa alimentándose y perjudicando las cosechas, limitando así la habilidad de los insecticidas baculovirales para completarla con agentes químicos.

[6] Este defecto se ha abordado mediante baculovirus genéticamente modificados que expresan neurotoxinas específicas de insecto. La expresión de toxinas de insecto heterólogas no sólo reduce el intervalo de tiempo entre la aplicación de virus y la muerte del insecto, sino que también reduce la media de tiempo de alimentación (Prikhoodko et al., Effects of simultaneous expression oftwo sodium channel toxic genes on the properties of baculoviruses as biopesticides, Biological Control 12, 66-78, 1998). De manera importante, la introducción de genes para las toxinas selectivas de insecto no altera la capacidad de infección intrínseca del baculovirus o su rango de anfitrión natural (Black et al., Commercialization of baculoviral insecticides, en The Baculoviruses (ed. Miller, L.K.) 341-387 (Plenum Press, New York, USA, 1997)).

[7] Nuevos enfoques en cuanto a cómo enfrentarse a las plagas de insecos han estimulado el interés en las toxinas de péptido a partir de venenos de animales, particularmente arañas y escorpiones, que se alimentan de especies de insectos.

[8] Zlotkin et al., An Excitatory and a Depressant Insect Toxin from Scorpion Venom both Affect Sodium Conductance and Possess a Common Binding Site, Arch. Biochem. and Biophysics 24, 877-887, 1985) publica dos toxinas selectivas de insecto a partir del veneno del escorpión Leiurus quinqestriatus, uno de los cuales indujo una rápida parálisis contractiva excitatoria de las larvas de mosca mientras que el otro indujo una parálisis flácida lenta depresora, con ambas afectando el comportamiento del sodio en las neuronas. De manera similar, la patente canadiense 2,5,658 (concedida en: junio 19, 199 a Zlotkin et al.) publica una proteína efectiva como insecticida llamada "LqhP35" derivada del escorpión Leiurus quinquestriatus hebraeus.

[9] Una cantidad de investigadores también reconocieron los venenos de araña como una posible fuente de toxinas específicas de insecto para aplicar en la agricultura (véase, Jackson et al., Ann Rev. Neurosci. 12, 45-

414 (1989)). Por ejemplo, las patentes estadounidenses con núms. 4,855,45 (concedida el: 8 de agosto de 1989 a Yoshloka et al.) y 4,918,17 (concedida el: 17 de abril de 199 a Nakajima et al.) ambas publican inhibidores de receptor de glutamato obtenidos a partir del veneno de arañas como posibles agentes insecticidas. En las patentes estadounidenses con números 5,457,178 (concedida el: 1 de octubre de 1995), 5,695,959 (concedida el: 9 de diciembre de 1997) y 5,756,459 (concedida el: 26 de mayo de 1998) a Jackson et al. publica una familia de proteínas efectivas como insecticida aisladas a partir del veneno de las arañas Filistata hibernalis (una araña común en las casas) y de las arañas Phidippus audax (una "araña saltadora").

[1] Un grupo particular de arañas que han generado un considerable interés en su investigación son las arañas de tela en embudo. WO 89/768 (publicada el: 24 de agosto de 1989 por Cherksey et al.) revela factores de bajo peso molecular aislados del veneno de las arañas de tela en embudo americanas que se enlaza de manera reversible a los canales de calcio. Adams et al., Isolation and Biológica! Activity of Synaptic Toxins from the Venom of the Funnel Web Spider, Agelenopsis aperia, in Insect Neurochemistry and Neurophysiology, Borkovec and Gelman (eds.) (Humana Press, New Jersey, 1986) describe cómo múltiples toxinas de péptido que antagonizan la transmisión sinóptica en Insectos se han aislado de la araña Agelenopsis aperta. En WO 93/1518, una clase de toxinas de péptido conocidas como las w-atracotoxinas se publican tras ser aisladas de las arañas de tela de embudo australianas (Araneae.Heathelidae.Atracinae) cribando el veneno para la actividad anti-Helicoverpa ("anti-gusano del algodón"). Dichas toxinas se publican con un peso molecular de aproximadamente 4 amu (masa atómica unificada), con entre 36-37 aminoácidos de longitud, y siendo capaces de formar tres enlazes de disulfuro dentro de la cadena. Uno de estos compuestos, llamado go-ACTX- Hv1 ha demostrado Inhibir selectivamente las corrientes de canal activadas por voltaje de un insecto, en lugar de las de un mamífero (Fletcher et al., The structure of a novel insecticida! neurotoxin, oj -atracotoxin-HV1, from the venom of an Australian funnel web spider, Nature Struct. Biol. 4, 559-566 (1997)). Se han aislado homólogos de co-ACTX-Hv1 a partir de la araña de las montañas azules de tela en embudo Hadromyche versuta (véase, Wang et al., Structure-function of cu-atrocotoxin, a potent antagonist of insect voltage-gates calcium channels, Eur. J., Biochem. 264, 488 - 494 (1999)).

[11] Mientras que algunas toxinas de péptido insecticida aisladas hasta ahora de los escorpiones y las arañas son alentadoras, sigue existiendo la necesidad de compuestos que muestren una amplia diferencia de toxicidad entre insectos y no insectos y que sigan teniendo una actividad insecticida significativa y actúen rápido.

[12] Los inventores presentes aislaron, y caracterizaron estructural y funcionalmente, una toxina insecticida novedosa, llamada u>-atracotoxina-Hv2a, a partir del veneno de una araña de red en embudo australiana H. versuta. Esta u>-atracotox¡na-Hv2a que es el objetivo de la toxina de la patente estadounidense 6,583,264 B2 es un antagonista altamente potente y específico de los canales de calcio de insecto. La toxina cü-atracotoxina-Hv2a de la invención publicada en la patente 6,583,264 B2 no muestra ninguna similitud de secuencia con otras toxinas insecticidas previamente aisladas y ninguna homología de secuencia o estructura con la familia de toxinas insecticidas de omega-atracotoxina-Hv1 anteriormente aislada a partir de H. versuta (véase Atkinson et al., Insecticidal toxins derived from funnel web spider (Atrax or Hadronyche)... [Seguir leyendo]

1. Un polipéptido aislado con una actividad insecticida de secuencia SEQ ID NO:2.

2. Un polipéptido aislado con una actividad insecticida derivado de la araña de tela en embudo Hadronyche versuta de secuencia SEQ ID NO:2.

3. Una composición insecticida comprendiendo una cantidad efectiva de insecticida del polipéptido según la reivindicación 1 y un portador aceptable en cuanto a la agricultura.

4. Un ácido nucléico aislado con una codificación de secuencia para el polipéptido según la reivindicación 1.

5. Un ácido nucléico aislado de acuerdo con la reivindicación 4 que es ADN.

6. Un vector de clonación comprendiendo un impulsor enlazado de manera operacional al ADN de la reivindicación 5 y opcionamente otros elementos de regulación que mejoran la expresión.

7. Un vector de clonación comprendiendo el ADN de acuerdo con la reivindicación 5.

8. Un baculovlrus recombinante u otro virus especifico de insecto comprendiendo un vector de acuerdo con la reivindicación 7.

9. Una célula recombinante comprendiendo un vector de acuerdo con la reivindicación 7.

1. Una célula recombinante de acuerdo con la reivindicación 9, donde la célula es una célula vegetal.

11. Una célula recombinante de acuerdo con la reivindicación 9, donde la célula es una célula procariótica.

12. Una expresión de tipo casete comprendiendo una codificación genética para el polipéptido según la

reivindicación 1.

13. Una secuencia nucleótide que codifica una toxina con una actividad inhibitoria en los canales de calcio de insecto donde dichos códigos de secuencia nucleótide para toda o parte de la secuencia de amino ácido de SEQ ID NO: 2.

14. Un microorganismo transformado con una secuencia nucleótide según la reivindicación 13.

15. Un método para controlar las plagas de Insectos comprendiendo el contacto de dichas plagas con una cantidad efectiva de Insecticida del polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1.

16. Un método para cribar las sustancias con una actividad antagonista respecto al canal de calcio activado por voltaje de un Insecto comprendiendo los pasos de: (a) cribar una serie de compuestos para determinar aquellos compuestos que Inhiben el enlace de un miembro de SEQ ID NO: 2 de acuerdo con la reivindicación 13, a los canales de calcio de Insecto y (b) probar la habilidad de dichos compuestos Inhibitorios para actuar como un antagonista de los canales de calcio de insecto.

17. Un método para cribar las sustancias con una actividad antagonista con respecto al canal de calcio activado por voltaje del insecto comprendiendo los pasos de: (a) cribar una serie de compuestos para determinar aquellos compuestos que Inhiben el enlace de un miembro de SEQ ID NO: 2 de acuerdo con la reivindicación 13, a los canales de calcio del Insecto; (b) cribar quellos compuestos que inhiben el enlace de dicho miembro del grupo para ¡nteractuar con los canales de calcio de insecto para identificar aquellos compuestos con una constante de disociación por su interacción con los canales de calcio del Insecto menor a 1'7M aproximadamente y (c) determinando si cualquier compuesto Identificado con una constante de disociación por su interacción con los canales de calcio del insecto tiene una actividad mínima contra los canales de calcio de vertebrados.