Composiciones y métodos para la biosíntesis de 1,4-butanodiol y sus precursores.

Organismo microbiano que no se produce de manera natural que tiene rutas biosintéticas de ácido 4- hidroxibutanoico (4-HB) y 1,

4-butanodiol (1,4-BDO), comprendiendo dichas rutas ácidos nucleicos exógenos que codifican para a) una α-cetoglutarato descarboxilasa, b) una 4-hidroxibutanoato deshidrogenasa, c) una butirato cinasa y una fosfotransbutirilasa, o una 4-hidroxibutiril-CoA:acetil-CoA transferasa, d) una aldehído deshidrogenasa y e) una alcohol deshidrogenasa, en el que dichos ácidos nucleicos exógenos se expresan en cantidades suficientes para producir 1,4-butanodiol (1,4-BDO).

Composiciones y métodos para la biosíntesis de 1, 4-butanodiol y sus precursores

Antecedentes de la invención Esta invención se refiere de manera general al diseño in silico de organismos y, más particularmente a organismos que tienen capacidad de biosíntesis de 1, 4-butanodiol.

El compuesto ácido 4-hidroxibutanoico (4-hidroxibutanoato, 4-hidroxibutirato, 4-HB) es un ácido carboxílico de 4 carbonos que tiene potencial industrial como elemento estructural para diversos productos químicos de materia prima y especializados. En particular, 4-HB tiene potencial para servir como nuevo punto de entrada en la familia de productos químicos de 1, 4-butanodiol, que incluye disolventes, resinas, precursores de polímeros y productos químicos especializados. El 1, 4-butanodiol (BDO) es un producto intermedio de polímeros y disolvente industrial con un mercado global de aproximadamente 3 billones de lb/año. BDO se produce actualmente a partir de precursores petroquímicos, principalmente acetileno, anhídrido maleico y óxido de propileno.

Por ejemplo, se hace reaccionar acetileno con 2 moléculas de formaldehído en la reacción de síntesis de Reppe (Kroschwitz y Grant, Encyclopedia of Chem. Tech., John Wiley and Sons, Inc., Nueva York (1999) ) , seguido por hidrogenación catalítica para formar 1, 4-butanodiol. Se ha estimado que el 90% del acetileno producido en los EE.UU. se consume para la producción de butanodiol. Alternativamente, puede formarse mediante esterificación e hidrogenación catalítica de anhídrido maleico, que se deriva de butano. Posteriormente, puede transformarse adicionalmente el butanodiol; por ejemplo, mediante oxidación para dar □-butirolactona, que puede convertirse adicionalmente en pirrolidona y N-metil-pirrolidona, o hidrogenolisis para dar tetrahidrofurano (figura 1) . Estos compuestos tienen diversos usos como productos intermedios de polímeros, disolventes y aditivos, y tienen un mercado combinado de casi 2 billones de lb/año.

Resulta deseable desarrollar un método para la producción de estos productos químicos mediante medios alternativos que no sólo sustituyan materias primas basadas en petróleo por renovables, y que también usen procedimientos que requieran menos energía y capital. El Departamento de Energía ha propuesto 1, 4-diácidos, y particularmente ácido succínico, como productos intermedios clave producidos de manera biológica para la fabricación de la familia de productos de butanodiol (Informe del DOE, “Top Value-Added Chemicals from Biomass”, 2004) . Sin embargo, el ácido succínico es costoso de aislar y purificar y requiere altas temperaturas y presiones para su reducción catalítica para dar butanodiol.

Por tanto, existe una necesidad de medios alternativos para producir eficazmente cantidades comerciales de 1, 4butanodiol y sus precursores químicos. La presente invención satisface esta necesidad y también proporciona ventajas relacionadas.

Sumario de la invención La invención se define por el contenido de las reivindicaciones.

La descripción proporciona un biocatalizador microbiano que no se produce de manera natural que incluye un organismo microbiano que tiene una ruta biosintética de ácido 4-hidroxibutanoico (4-HB) que tiene al menos un ácido nucleico exógeno que codifica para 4-hidroxibutanoato deshidrogenasa, succinil-CoA sintetasa, semialdehído succínico deshidrogenasa dependiente de CoA o α-cetoglutarato descarboxilasa, en el que el ácido nucleico exógeno se expresa en cantidades suficientes para producir ácido 4-hidroxibutanoico monomérico (4-HB) . También se proporciona un biocatalizador microbiano que no se produce de manera natural que incluye un organismo microbiano que tiene rutas biosintéticas de ácido 4-hidroxibutanoico (4-HB) y 1, 4-butanodiol (BDO) , las rutas incluyen al menos un ácido nucleico exógeno que codifica para 4-hidroxibutanoato deshidrogenasa, succinil-CoA sintetasa, semialdehído succínico deshidrogenasa dependiente de CoA, 4-hidroxibutirato:CoA transferasa, 4-butirato cinasa, fosfotransbutirilasa, α-cetoglutarato descarboxilasa, aldehído deshidrogenasa, alcohol deshidrogenasa o una aldehído/alcohol deshidrogenasa, en el que el ácido nucleico exógeno se expresa en cantidades suficientes para producir 1, 4-butanodiol (BDO) . Adicionalmente, se proporciona un método para la producción de 4-HB. El método incluye cultivar un organismo microbiano que no se produce de manera natural que tiene una ruta biosintética de ácido 4-hidroxibutanoico (4-HB) que incluye al menos un ácido nucleico exógeno que codifica para 4hidroxibutanoato deshidrogenasa, succinil-CoA sintetasa, semialdehído succínico deshidrogenasa dependiente de CoA o α-cetoglutarato descarboxilasa en condiciones sustancialmente anaerobias durante un periodo de tiempo suficiente para producir ácido 4-hidroxibutanoico monomérico (4-HB) . Además, se proporciona un método para la producción de BDO. El método incluye cultivar un biocatalizador microbiano que no se produce de manera natural, que comprende un organismo microbiano que tiene rutas biosintéticas de ácido 4-hidroxibutanoico (4-HB) y 1, 4butanodiol (BDO) , incluyendo las rutas al menos un ácido nucleico exógeno que codifica para 4-hidroxibutanoato deshidrogenasa, succinil-CoA sintetasa, semialdehído succínico deshidrogenasa dependiente de CoA, 4hidroxibutirato:CoA transferasa, 4-hidroxibutirato cinasa, fosfotranshidroxibutirilasa, α-cetoglutarato descarboxilasa, aldehído deshidrogenasa, alcohol deshidrogenasa o una aldehído/alcohol deshidrogenasa durante un periodo de tiempo suficiente para producir 1, 4-butanodiol (BDO) . Los productos 4-HB y/o BDO pueden secretarse al medio de cultivo.

Breve descripción de los dibujos La figura 1 es un diagrama esquemático que muestra un punto de entrada de ácido 4-hidroxibutanoico (4-HB) en la línea de productos de la familia de productos químicos de 1, 4-butanodiol (BDO) , y la comparación con rutas de síntesis química a partir de materias primas petroquímicas. Las flechas negras continuas muestran rutas de síntesis química; las flechas azules discontinuas muestran una ruta biosintética para dar 4-HB y posteriores etapas de conversión para dar productos químicos de la familia de BDO.

La figura 2 es un diagrama esquemático que muestra rutas bioquímicas para dar 4-hidroxibutirato (4-HB) y para la producción de 1, 4-butanodiol. Las primeras 5 etapas son endógenas para E. coli, mientras que el resto pueden expresarse de manera heteróloga. Las enzimas que catalizan las reacciones biosintéticas son: (1) succinil-CoA sintetasa; (2) semialdehído succínico deshidrogenasa independiente de CoA; (3) α-cetoglutarato deshidrogenasa;

(4) glutamato:succinato semialdehído transaminasa; (5) glutamato descarboxilasa; (6) semialdehído succínico deshidrogenasa dependiente de CoA; (7) 4-hidroxibutanoato deshidrogenasa; (8) α-cetoglutarato descarboxilasa; (9) 4-hidroxibutiril-CoA:acetil-CoA transferasa; (10) butirato cinasa; (11) fosfotransbutirilasa; (12) aldehído deshidrogenasa; (13) alcohol deshidrogenasa.

La figura 3 es un diagrama esquemático que muestra la biosíntesis de homoserina en E. coli.

La figura 4 muestra un diagrama esquemático de una biorruta de homoserina predicha a partir de L-homoserina para dar 4-HB. La etapa 1 es una amoniaco liasa deducida (clase EC 4.3.1) con una rxnG estimada de 12 kJ/mol. La etapa 2 es una oxidorreductasa deducida (clase EC 1.3.1) con una rxnG estimada de -59 kJ/mol.

La figura 5 muestra un diagrama esquemático para la ruta de E. coli endógena para la conversión de aspartato en succinato por medio de fumarato. Esta ruta muestra una química similar a la biorruta de homoserina predicha.

La figura 6 muestra un diagrama esquemático que ilustra los paralelismos entre las rutas biosintéticas de (A) homoserina y (B) succinil-CoA para dar BDO.

La figura 7 es un diagrama esquemático que muestra las rutas bioquímicas para dar acetoacetato en E. coli.

La figura 8 es un diagrama esquemático que muestra una ruta bioquímica a partir de acetoacetato para dar BDO por medio de semialdehído succínico.

La figura 9 es un diagrama esquemático que muestra un esquema de reacción de D-lisina-5, 6-aminomutasa.

La figura 10 es un diagrama esquemático que muestra una ruta para dar acetoacetato a partir de acetil-CoA. Las enzimas son: (1) piruvato-formiato liasa, (2) piruvato deshidrogenasa, (3) acetil-CoA:acetoacetil-CoA transferasa, (4) acetil-CoA C-acetil transferasa, (5) fosfotransacetilasa y (6) acetato cinasa. La enzima 7 representa la ruta de múltiples etapas de acetoacetato a BDO en la figura 8.

La figura 11 muestra la producción de 4-HB en medio... [Seguir leyendo]

1. Organismo microbiano que no se produce de manera natural que tiene rutas biosintéticas de ácido 4hidroxibutanoico (4-HB) y 1, 4-butanodiol (1, 4-BDO) , comprendiendo dichas rutas ácidos nucleicos exógenos que codifican para a) una α-cetoglutarato descarboxilasa, b) una 4-hidroxibutanoato deshidrogenasa, c) una butirato cinasa y una fosfotransbutirilasa, o una 4-hidroxibutiril-CoA:acetil-CoA transferasa, d) una aldehído deshidrogenasa y e) una alcohol deshidrogenasa, en el que dichos ácidos nucleicos exógenos se expresan en cantidades suficientes para producir 1, 4-butanodiol (1, 4-BDO) .

2. Organismo microbiano que no se produce de manera natural según la reivindicación 1, en el que dichos ácidos nucleicos exógenos comprenden al menos un ácido nucleico heterólogo.

3. Organismo microbiano que no se produce de manera natural según la reivindicación 1, que comprende además un medio de cultivo sustancialmente anaerobio. 15

4. Método para la producción de 1, 4-BDO que comprende cultivar el organismo microbiano que no se produce de manera natural según la reivindicación 1 en condiciones sustancialmente anaerobias durante un periodo de tiempo suficiente para producir 1, 4-BDO.

5. Método según la reivindicación 4, en el que al menos un ácido nucleico exógeno comprende un ácido nucleico heterólogo.