Composiciones y métodos para detectar afecciones precancerosas en muestras celulares y de tejidos mediante 5, 10, 15, 20-tetrakis (carboxifenil) porfina.

Método para pronosticar la respuesta de un paciente a un tratamiento contra el cáncer,

el método comprende:

a) previamente al tratamiento, poner en contacto la muestra de células in vitro del paciente con una solución de 5, 10, 15, 20-tetrakis (carboxifenil) porfina (TCPP) en condiciones que permitan la unión de TCPP a los componentes de las células displásicas o carcinómicas, si están presentes, en el que la solución de TCPP comprende TCPP previamente disuelta en alcohol basificado del 50% al 90% y a un pH entre 8,5 y 12,0 y diluido en una solución acuosa tamponada;

b) eliminar la TCPP no unida a la muestra;

c) detectar la fluorescencia de TCPP en la muestra, la presencia de dicha fluorescencia indica que la muestra contiene células displásicas o carcinómicas;

d) realizar los pasos a-c en otra muestra de tejido u órgano que se está tratando contra el cáncer del paciente, a intervalos durante el tratamiento y tras la finalización de este; y

e) determinar si el porcentaje de células precancerosas o cancerosas anormales de las muestras que se han analizado durante el tratamiento y tras la finalización de este es inferior al compararlo con la muestra analizada previamente al tratamiento, dicha reducción será un pronóstico de la respuesta del paciente al tratamiento contra el cáncer.

Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E11159888.

Solicitante: bioAffinity Technologies, Inc.

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: 25000 Network Blvd., No. 308 San Antonio, TX 78249 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: GARWIN, JEFFREY L.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • A61K31/409 SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA.A61 CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE.A61K PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO (dispositivos o métodos especialmente concebidos para conferir a los productos farmacéuticos una forma física o de administración particular A61J 3/00; aspectos químicos o utilización de substancias químicas para, la desodorización del aire, la desinfección o la esterilización, vendas, apósitos, almohadillas absorbentes o de los artículos para su realización A61L;   composiciones a base de jabón C11D). › A61K 31/00 Preparaciones medicinales que contienen ingredientes orgánicos activos. › teniendo cuatro de estos ciclos, p. ej. derivados de la porfina bilirrubina, biliverdina (hemina, hematina A61K 31/555).
  • G01N21/64 SECCION G — FISICA.G01 METROLOGIA; ENSAYOS.G01N INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION DE SUS PROPIEDADES QUIMICAS O FISICAS (procedimientos de medida, de investigación o de análisis diferentes de los ensayos inmunológicos, en los que intervienen enzimas o microorganismos C12M, C12Q). › G01N 21/00 Investigación o análisis de los materiales por la utilización de medios ópticos, es decir, utilizando rayos infrarrojos, visibles o ultravioletas (G01N 3/00 - G01N 19/00 tienen prioridad). › Fluorescencia; Fosforescencia.
  • G01N33/15 G01N […] › G01N 33/00 Investigación o análisis de materiales por métodos específicos no cubiertos por los grupos G01N 1/00 - G01N 31/00. › preparaciones medicinales.
  • G01N33/48 G01N 33/00 […] › Material biológico, p. ej. sangre, orina (G01N 33/02, G01N 33/26, G01N 33/44, G01N 33/46 tienen prioridad ); Hemocitómetros (cómputo de glóbulos repartidos sobre una superficie por barrido óptico de la superficie G06M 11/02).
  • G01N33/50 G01N 33/00 […] › Análisis químico de material biológico, p. ej. de sangre, de orina; Investigación o análisis por métodos en los que interviene la formación de uniones bioespecíficas con grupos coordinadores; Investigación o análisis inmunológico (procedimientos de medida, de investigación o análisis diferentes de los procedimientos inmunológicos en los que intervienen enzimas o microorganismos, composiciones o papeles reactivos a este efecto; procedimientos para preparar estas composiciones, procedimientos de control sensibles a las condiciones del medio en los procedimientos microbiológicos o enzimáticos C12Q).
  • G01N33/52 G01N 33/00 […] › Utilización de compuestos o de composiciones para investigaciones colorimétricas, espectrofotométricas o fluorométricas, p. ej. utilización de cintas de papel indicador.
  • G01N33/574 G01N 33/00 […] › para el cáncer.

PDF original: ES-2523378_T3.pdf

 


Fragmento de la descripción:

Composiciones y métodos para detectar afecciones precancerosas en muestras celulares y de tejidos mediante 5, 10, 15, 20-tetrakis (carboxifenil) porfina

Sector de la invención

La presente invención se refiere a la utilización de ciertas porfirinas para detectar la presencia de células cancerosas, precancerosas y displásicas en varias muestras de tejido in vitro.

Antecedentes de la invención

En el presente documento se hace referencia entre paréntesis a varios artículos científicos y académicos.

Los patólogos, expertos que examinan la progresión de la enfermedad y analizan muestras de tejido en busca de anomalías, entre ellas el cáncer, han determinado que una afección celular que se conoce como displasia, que consiste en una formación o maduración anormal de las células, puede identificar potencialmente células en afecciones precancerosas. Si no se trata, la displasia puede avanzar del estado, leve, moderado hasta grave, y en ocasiones puede llevar a la aparición del cáncer. Aproximadamente uno de cada siete casos moderados de displasia llega a provocar cáncer, y hasta un 83% de casos de displasia grave han llevado sus enfermos a desarrollar cáncer, en función de las células implicadas en el proceso. Sin embargo, la eliminación de células displásicas en estado leve y moderado reduce significativamente el desarrollo de cáncer. En el caso concreto de los pulmones, la eliminación de células displásicas no solamente disminuye notablemente la formación de células cancerosas, sino que además en algunos casos el tejido pulmonar recupera su morfología normal.

En general, cuanto antes se detecta un cáncer, más probabilidades tendrá el paciente de sobrevivir. Si el cáncer de mama se detecta de forma temprana cuando todavía se encuentra en una única masa, la tasa de supervivencia a 5 años es del 96%. Cuando este cáncer se ha extendido a una ubicación más alejada, dicha tasa es inferior al 20%. En el caso del cáncer de pulmón cuando se detecta una única masa la tasa de supervivencia a 5 años es superior al 46%. Cuando dicho cáncer se ha extendido, la tasa pasa a ser inferior al 14%. En lo que se refiere al cáncer de cérvix la tasa de supervivencia aumenta cuando se detectan cambios precancerosos y se tratan antes de llegar a un estado más grave (Boring y Squires 1993, CA Cáncer J Clin 43:7-26 and Ferguson 1990, Hematol Oncol Clin N Am 4:1053-1168).

Actualmente el carcinoma pulmonar es la principal causa de mortalidad debida al cáncer en hombres y mujeres en los Estados Unidos (Wlngo y otros 1995, CA Clinical J Clin 45:8-30). En 1997 murieron aproximadamente 160.000 personas a causa del cáncer de pulmón, cifra que representa el 12% de todas las muertes debidas al cáncer en Estados Unidos en hombres y el 2% en mujeres (Boring y Squires 1993, supra). El cáncer de pulmón también es uno de los cánceres más letales, tal y como se desprende de la tasa de supervivencia a 5 años de tan solo el 14%. El mal pronóstico de los pacientes de cáncer de pulmón, en comparación con otros tipos de cáncer que afectan al ser humano, se debe en gran medida a la falta de métodos de detección en sus primeros estadios. Cuando se presentan síntomas clínicos, más de dos tercios de los pacientes tiene afectación de los ganglios regionales o metástasis distantes, y habitualmente ambos casos son incurables. Sin embargo, en estudios realizados en pacientes con cáncer de pulmón localizado (Estadio 0 o 1), las tasas de supervivencia a 5 años oscilaban entre el 40 y el 70% (Boring y Squires, 1993, supra; Ferguson 1990, supra).

Históricamente, la única prueba de diagnóstico que se utilizaba para detectar el cáncer de pulmón antes de la aparición de sus síntomas era la citología de esputo y radiografías de tórax. Como consecuencia se ha evaluado mucho la eficacia de dichas pruebas, realizando estudios durante las últimas décadas. Ambas pruebas eran capaces de detectar carcinomas presintomáticos en los primeros estadios de desarrollo, en especial el carcinoma de células escamosas.

Las mejoras en los métodos de control se han centrado especialmente en la mejora de la utilización de la citología de esputo gracias a los avances tecnológicos en microscopia. Para realizar la citología de esputo se precisa de un análisis visual de la muestra celular en el que se utilizan el tamaño, forma, organización de la célula, y relación entre el tamaño del núcleo celular y su citoplasma, para determinar la morfología de la célula. Teniendo en cuenta que para esta evaluación de la morfología celular se precisa de una inspección y clasificación visual, el encargado de la observación clínica que desempaña esta técnica debe disponer de un alto grado de experiencia. Se han realizado diversas investigaciones cuyos resultados sugieren que un método de análisis de imágenes de alta resolución asistido por ordenador permite la detección de cambios subvisuales en núcleos de apariencia normal en varios tipos de tejido (Montag y otros 1991, Anal Quant Cytol Histol 13:159-167; Haroske y otros 1988, Arch Geschwulstforsch, 58:159-168; Hutchinson y otros 1992, Anal Quant Cytol Estol 4:330-334). Los análisis asistidos por ordenador de distribución del ADN en muestras celulares clasificaron correctamente el 74% de los núcleos según su morfología sin necesidad de que un experto revisara el material y sin la presencia de núcleos visualmente anormales cuando se comparó con el test citológico estándar.

La evaluación morfológica de las muestras cltológicas también ha mejorado gracias a los avances realizados en la comprensión del cáncer de pulmón. Gran parte de este trabajo se ha centrado en la identificación de los "biomarcadores". Los biomarcadores son una amplia gama de anomalías genéticas y fenotípicas progresivas de la mucosa respiratoria que se pueden utilizar para determinar el potencial del epitelio bronquial para convertirse en su totalidad en un tumor maligno. Los marcadores se han clasificado de forma amplia como cambios morfológicos, marcadores imunohistoquímicos de varias proteínas expresadas, marcadores de inestabilidad genómlca, marcadores de cambios epigenéticos (por ejemplo, metilaclón anormal), y mutaciones genéticas (Hirsch y otros 1997, Lung Cáncer 17:163-174).

Actualmente se están evaluando los niveles de expresión de dichos marcadores en muestras de tejido cito/histológico displáslco y neoplásico procedentes de poblaciones de riesgo elevado. De entre estas muestras, actualmente se ha seleccionado el esputo para realizar análisis de marcadores. El Interés que suscitan las muestras de esputo en la Investigación de biomarcadores procede de la antigua creencia de que las células exfoliadas que se recuperan en el esputo pueden ser la indicación más temprana de un carcinoma Incipiente, ya que en la mayoría de los casos el cáncer de pulmón se desarrolla en el epitelio bronquial. Mediante el uso de sofisticadas técnicas de genética molecular (por ejemplo, ensayos basados en PCR), los resultados de ciertos estudios demuestran que los biomarcadores seleccionados se pueden detectar en esputo. (Mao y otros 1994, Cáncer Res 54:1634-1637, Mao y otros 1994, Proc Nati Acad Sel USA 91:9871-9875; Sidransky 1995, J Nati Cáncer Inst 87:1201-1202; Tockman y otros 1988, J Clin Oncol, 11:1685-1693; Tockman y otros 1994, Chest, 106:385s-390s).

Los servicios de control y detección del cáncer disponibles en el mercado se fundamentan en pruebas basadas en diagnósticos citomorfológicos realizados por médicos expertos que observan cada una de las muestras y determinan la extensión e identifican los tipos de células anormales. Este proceso no tan solo es costoso y lento, sino que además incluye el criterio de un experto y por lo tanto un factor de error en el procedimiento. Recientemente se ha desarrollado un método para detectar células cancerosas en el pulmón mediante la utilización de 5, 10, 15, 20- tetrakis (carboxifenil)-porf¡na (TCPP) (patente de los Estados Unidos 5.162.231 a Colé y otros). Dicho método se basa en la tendencia de las células cancerosas a acumular una mayor cantidad de TCPP procedente de su entorno que las células no cancerosas. Tras incubar una muestra celular durante 6-24 horas con 200 pg/ml de TCPP, dicha TCPP entró en las células y se unió a la membrana perinuclear y las mitocondrias de las células neopláslcas. La TCPP es fluorescente con luz ultravioleta, y por lo tanto se pueden identificar las células cancerosas simplemente por su Intensidad de fluorescencia, sin necesidad de observar la morfología. La utilización más amplia de este compuesto para identificar afecciones de tejido precanceroso (por ejemplo, células displásicas) permitiría el control en poblaciones de alto riesgo para identificar aquellos... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Método para pronosticar la respuesta de un paciente a un tratamiento contra el cáncer, el método comprende:

a) previamente al tratamiento, poner en contacto la muestra de células in vitro del paciente con una solución de 5, 10, 15, 20-tetrakis (carboxifenil) porfina (TCPP) en condiciones que permitan la unión de TCPP a los componentes de las células displásicas o carcinómicas, si están presentes, en el que la solución de TCPP comprende

TCPP previamente disuelta en alcohol basificado del 50% al 90% y a un pH entre 8,5 y 12,0 y diluido en una solución acuosa tamponada;

b) eliminar la TCPP no unida a la muestra;

c) detectar la fluorescencia de TCPP en la muestra, la presencia de dicha fluorescencia indica que la muestra contiene células displásicas o carcinómicas;

d) realizar los pasos a-c en otra muestra de tejido u órgano que se está tratando contra el cáncer del paciente, a Intervalos durante el tratamiento y tras la finalización de este; y

e) determinar si el porcentaje de células precancerosas o cancerosas anormales de las muestras que se han analizado durante el tratamiento y tras la finalización de este es inferior al compararlo con la muestra analizada previamente al tratamiento, dicha reducción será un pronóstico de la respuesta del paciente al tratamiento contra el cáncer.

2. Método, según la reivindicación 1, que además comprende la separación de células mediante cltometrfa de flujo por fluorescencia en una población que comprende células normales y una población que comprende células cancerosas y precancerosas anormales.

3. Método para pronosticar la respuesta de un paciente a un tratamiento contra el cáncer, en el que dicho método comprende los pasos siguientes:

a) poner en contacto las células de una muestra de células no fijadas obtenidas, previamente al tratamiento, de tejido o un órgano que se está tratando contra el cáncer del paciente, in vitro con una solución de 5, 10, 15, 20- tetrakis (carboxifenil) porflna (TCPP) en condiciones que permitan la unión de TCPP a los componentes de las células displásicas o carcinómicas, si están presentes, en el que la solución de TCPP comprende TCPP previamente disuelto en alcohol basificado del 50% al 90% y a un pH entre 8,5 y 12,0 y diluido en una solución acuosa tamponada;

b) eliminar la TCPP no unida a la muestra;

c) detectar la fluorescencia de TCPP en la muestra, la presencia de dicha fluorescencia indica que la muestra contiene células displásicas o carcinómicas;

d) separar las células en células de baja o nula fluorescencia y células de elevada fluorescencia mediante citometría de flujo por fluorescencia, siendo las poblaciones de baja o nula fluorescencia normales o metaplásicas, siendo las poblaciones de elevada fluorescencia displásicas o carcinómicas;

e) tratar las poblaciones de células separadas con un agente terapéutico contra el cáncer potencial in vitro\ y

f) observar el efecto del agente en cada una de las dos poblaciones de células, siendo deseable observar que el efecto del agente es negativo en la población de células displásicas o carcinómicas, y que no lo es, o lo es en menor grado, en la población de células normales, lo que representa un pronóstico de la respuesta de un paciente al tratamiento contra el cáncer.

4. Método de detección de células displásicas o carcinómicas en un tejido diana específico del paciente, en el que dicho método comprende las etapas siguientes:

a) introducir en el tejido diana una solución in vitro de TCPP en condiciones que permitan la unión de TCPP a los componentes de las células displásicas o carcinómicas, si están presentes, en el que la solución de TCPP comprende TCPP previamente disuelto en alcohol basificado del 50% al 90% y a un pH entre 8,5 y 12,0 y diluido en una solución acuosa tamponada;

b) eliminar la TCPP no unida del tejido diana;

c) detectar la fluorescencia de TCPP en la muestra, la presencia de dicha fluorescencia de TCPP indica que el tejido diana contiene células displásicas o carcinómicas;

5. Método, según la reivindicación 4, en el que el tejido diana se selecciona del grupo que comprenden pulmón, mama, glándula prostética, cérvlx, garganta, vejiga, orofarlnge, piel y tracto gastrointestinal.

6. Método de preparación de la solución de TCPP, que comprende la disolución de TCPP en una solución alcohólica acuosa que comprende alcohol del 50 al 90%, y cuyo pH es de 8,5 a 12.

7. Método, según la reivindicación 6, en el que el alcohol es ¡sopropanol.

8. Método, según la reivindicación 6, en el que el pH se ajusta mediante bicarbonato de sodio e hidróxido de amonio.

9. Método, según la reivindicación 6, en el que la TCPP disuelta representa 2 mg/ml o menos.

10. Una composición que comprende TCPP disuelta en una solución alcohólica acuosa de alcohol del 50 al 90% a un pH entre 8,5 y 12,0.

11. Composición, según la reivindicación 10, en la que la concentración de TCPP en la solución es de 2 mg/ml o menos.

12. Composición, según la reivindicación 10, en la que el alcohol es isopropanol.

13. Composición, según la reivindicación 10, en la que el pH se ajusta mediante bicarbonato de sodio e hidróxido de amonio.

14. Composición, según la reivindicación 10, en la que se Incluye 1 mg/ml de Isopropanol en isopropanol al 50% y 15 bicarbonato de sodio 50 nm.

15. Kit de detección de células displásicas o carclnómlcas en una muestra, dicho kit comprende TCPP en un contenedor que comprende la composición según la reivindicación 10.


 

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