Composiciones y métodos de terapia de la fibrosis quística.

Una construcción de ácido nucleico que comprende una secuencia potenciadora y promotora unida operativamente a una secuencia para la expresión,

en la que la secuencia potenciadora y promotora comprende:

(i) una secuencia de los nucleótidos 7 a 538 de SEC ID Nº 1; o

(ii) una secuencia de al menos 200 nucleótidos de (i); o

(iii) una secuencia de al menos un 80 % de identidad de secuencia con (i),

en la que la secuencia potenciadora y promotora comprende menos de dinucleótidos CpG.

Composiciones y métodos de terapia de la fibrosis quística Campo de la invención La presente invención se refiere a construcciones. La invención también se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden las construcciones, al uso de las construcciones en la fabricación de medicamentos, así como al uso de las construcciones en diversos métodos.

Antecedentes de la invención En las construcciones para la expresión génica, se usa una variedad de promotores. Con frecuencia, la elección del promotor se ve influida por el uso específico para el que se emplea la construcción. Sin embargo, en general, se desean construcciones que proporcionen una expresión de alto nivel durante un período sostenido, particularmente para aplicaciones terapéuticas, pero también para cuando se desea expresar genes para cosechar las proteínas expresadas y, en casos tales como la agricultura, para obtener características deseadas en animales de cría.

En el uso de construcciones en un contexto terapéutico, la expresión sostenida a un alto nivel es particularmente importante. La obtención de una expresión sostenida y de alto nivel puede significar que un determinado tratamiento se tenga que administrar con menor frecuencia y que conserve su eficacia durante más tiempo. En condiciones crónicas y en defectos genéticos heredados, esto puede cobrar una particular importancia cuando, en esencia, el defecto subyacente se traduce en la necesidad de un tratamiento continuo. Los ejemplos de dichas condiciones incluyen la fibrosis quística, donde el tratamiento puede tener que administrarse de manera permanente y, por tanto, cualquier medio para aumentar el intervalo entre los tratamientos es importante.

Las construcciones de expresión génica pueden adolecer de una variedad de problemas. En algunos casos, la expresión puede ser solo por un breve período de tiempo antes de su silenciamiento. Esto ocurre particularmente in vivo y en una variedad de tejidos. Además, o como alternativa, algunas construcciones solo dan lugar a una expresión muy débil e inadecuada para lograr el efecto deseado.

Un problema adicional con algunas construcciones para la expresión génica cuando se emplean in vivo es que pueden activar el sistema inmune del sujeto de una manera no deseada. Por lo tanto, un sujeto puede presentar una respuesta inmune contra determinadas construcciones de expresión de genes virales que limitan su eficacia, especialmente cuando se usan repetidamente en el mismo sujeto, que puede ser el caso descrito anteriormente para muchas afecciones.

Breve descripción de los dibujos La Figura 1 representa la estructura de la construcción pGM160 en la que se pueden clonar secuencias para la expresión a partir del promotor hCEFI. La Figura 2 representa la estructura de la construcción pGM151 en la que las secuencias de codificación para el polipéptido CFTR se clonan en la unión operativa con el promotor hCEFI. La Figura 3 representa la estructura de la construcción pGM144 en la que las secuencias de codificación para el polipéptido indicador de luciferasa se clonan en la unión operativa con el promotor hCEFI. La Figura 4a representa niveles de síntomas gripales e inflamación pulmonar tras la administración a ratones de construcciones con contenido de dinucleótidos CpG decreciente con, de izquierda a derecha en cada gráfico, 317 dinucleótidos CpG, 193 dinucleótidos CpG, 0 dinucleótidos CpG y ratones de control a quienes no se ha administrado una construcción. Se muestran los niveles de TNF-α, IFN- e IL-12, así como el número de neutrófilos del BALF (fluido pulmonar de lavado broncoalveolar) . La Figura 4b muestra el efecto de la adición de un solo motivo CpG a una construcción en la respuesta inflamatoria a la construcción en el pulmón de un ratón. Más concretamente, la Figura 4b muestra el efecto de la adición de un solo dinucleótido CpG a una construcción sin dinucleótidos CpG. De izquierda a derecha en cada gráfico, se muestran los resultados para una construcción con 317 dinucleótidos CpG, un solo dinucleótido CpG, ningún dinucleótido CpG y los ratones de control sin tratar. La Figura 4c muestra que la sustitución del gen Lux con un gen CFTR sin dinucleótidos CpG no tiene ningún efecto sobre la respuesta inflamatoria observada. La Figura 5 muestra los niveles de expresión en el pulmón a lo largo del tiempo tras la administración en aerosol GL67 de las construcciones pG4hCEFI soLux (expresión desde un promotor hCEFI de la invención) , pG4GZB soLux (emplea el potenciador y promotor CMV humano) , pG4mCEFI soLux (emplea el potenciador CMV murino y la promotor EFIa humano) , pG2Ubc Lux (emplea el promotor poliubiquitina C humano) y pG1 CMV lux (que emplea el promotor y el potenciador CMV-IE) . La Figura 6 muestra los niveles de expresión en el pulmón a lo largo del tiempo tras la administración en aerosol PEI de las construcciones pG4 hCEFI soLux, pG4GZB soLux, pG4mCEFI soLux y pG3mCEFI soLux. Las Figuras 7a y b muestran vectores de primera, segunda, tercera y cuarta generación, con el número de dinucleótidos CpG representado en forma de piruletas e indicado en el centro de cada construcción.

La Figura 8 muestra los niveles de expresión en el pulmón a lo largo del tiempo tras la administración en aerosol GL67 de las construcciones pG2EFla Lux (emplea el promotor EFIa y tiene 245 CpG) , pG2CEF1a Lux (emplea el potenciador CMV humano y el promotor EF1a, y tiene 262 CpG) , pG2hCEFI Lux (emplea un potenciador CMV humano sin CpG y un promotor EFIa humano, la construcción tiene 149 CpG) y pG4hCEFI soLux (emplea un potenciador CMV humano sin CpG y un promotor EFIa humano y toda la estructura carece de CpG) . La Figura 9 muestra los niveles de expresión en el pulmón durante 56 días tras la administración en aerosol GL67 de las construcciones pG4hCEFI soLux y pG4EF1 soLux (emplea un promotor EFIa humano sin CpG y la construcción entera carece de CpG) .

Breve descripción de las secuencias La SEC ID Nº 1 es la secuencia de polinucleótido de la construcción pGM160 para la clonación de secuencias para la expresión usando el promotor hCEFI.

La SEC ID Nº 2 es la secuencia de polinucleótido de la construcción pGM151, que incluye las secuencias de codificación para CFTR que no contienen dinucleótidos CpG y que también se han optimizado en codones para la expresión (soCFTR) . La invención también permite una secuencia de polinucleótidos alternativa de CFTR en la que el nucleótido 2595 es C, el nucleótido 3234 es T y el nucleótido 3236 es C.

La SEC ID Nº 3 es la secuencia polipeptídica del polipéptido CFTR codificada por la construcción pGM151 de SEC ID Nº 2. La invención también permite una secuencia polipeptídica alternativa de CFTR en la que el aminoácido 620 es H (histidina) y el aminoácido 833 es F (fenilalanina) .

La SEC ID Nº 4 es la secuencia de polinucleótido de la construcción pGM144, que incluye las secuencias de codificación para un polipéptido de luciferasa, que no contiene dinucleótidos CpG y que también se han optimizado en codones para la expresión (soLux) .

La SEC ID Nº 5 es la secuencia polipeptídica del polipéptido luciferasa codificado por la construcción pGM144 de la SEC ID Nº 4.

Sumario de la invención La presente invención proporciona una construcción de ácido nucleico que comprende una secuencia potenciadora y promotora unida operativamente a una secuencia para la expresión, en la que la secuencia potenciadora y promotora comprende:

(i) una secuencia de los nucleótidos 7 a 538 de SEC ID Nº 1; o

(ii) una secuencia de al menos 200 nucleótidos de (i) ; o

(iii) una secuencia de al menos un 80 % de identidad de secuencia con (i) .

en la que la secuencia potenciadora y promotora comprende menos de 15 dinucleótidos CpG.

La construcción puede ser una construcción plasmídica.

En la construcción, la secuencia potenciadora y promotora puede no comprender dinucleótido CpG alguno.

La construcción puede no comprender dinucleótido CpG alguno.

En la construcción, la secuencia para la expresión puede codificar un polipéptido terapéutico.

En la construcción, la secuencia por expresar puede codificar un polipéptido CFTR, donde la construcción comprende:

(i) la secuencia de SEC ID Nº 2 o la secuencia de SEC ID Nº 2 en la que el nucleótido 2595 es C y/o el nucleótido 3234 y 3236 son T y C respectivamente; o

(ii) una construcción con al menos un 70 % de identidad de secuencia con (i) .

En un aspecto adicional, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende una construcción de la invención y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.

1. Una construcción de ácido nucleico que comprende una secuencia potenciadora y promotora unida operativamente a una secuencia para la expresión, en la que la secuencia potenciadora y promotora comprende:

(i) una secuencia de los nucleótidos 7 a 538 de SEC ID Nº 1; o

(ii) una secuencia de al menos 200 nucleótidos de (i) ; o

(iii) una secuencia de al menos un 80 % de identidad de secuencia con (i) ,

en la que la secuencia potenciadora y promotora comprende menos de 15 dinucleótidos CpG.

2. Una construcción de acuerdo con la reivindicación 1, que es una construcción plasmídica.

3. Una construcción de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la que la secuencia potenciadora y promotora no comprende ningún dinucleótido CpG.

4. Una construcción de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que la construcción no comprende ningún dinucleótido CpG.

5. Una construcción de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que la secuencia para la expresión codifica un polipéptido terapéutico.

6. Una construcción de acuerdo con la reivindicación 5, en la que la secuencia que se va a expresar codifica un polipéptido CFTR, donde la construcción comprende:

(i) la secuencia de SEC ID Nº 2 o la secuencia de SEC ID Nº 2 en la que el nucleótido 2595 es C y/o el nucleótido 3234 y 3236 son T y C respectivamente; o

(ii) una construcción con al menos un 70 % de identidad de secuencia con (i) .

7. Una composición farmacéutica que comprende una construcción de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.

8. Una construcción de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para su uso en un método de tratamiento del cuerpo humano o animal mediante terapia o cirugía, o para su uso como un medicamento.

9. Uso de una construcción de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en la fabricación de un medicamento para su uso en el tratamiento de un trastorno genético, una afección crónica, cáncer, alergia, autoinmunidad, infección o un cáncer.

10. Uso de acuerdo con la reivindicación 9, en el que la enfermedad que se va a tratar es un trastorno de las vías respiratorias.

11. Un método no terapéutico de expresión de una secuencia en un sujeto animal no humano, método que comprende administrar una construcción de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que la secuencia potenciadora y promotora está unida operativamente a una secuencia no terapéutica para la expresión.

12. Un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia o el complemento de una secuencia, seleccionado del grupo que comprende:

(i) la secuencia de ácido nucleico de los nucleótidos 738 a 5180 de SEC ID Nº 2; y

(ii) la secuencia de ácido nucleico de los nucleótidos 738 a 5180 de SEC ID Nº 2 en la que el nucleótido 2595 es modificado de A a C y/o los nucleótidos 3234 y 3236 son modificados de C a T y de G a C, respectivamente.

13. Un método in vitro o ex vivo de expresión de un gen en una célula, un tejido o un órgano, método que comprende introducir una construcción de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en dichas células, tejido u órgano.

14. Una secuencia potenciadora y promotora aislada, siendo la secuencia potenciadora y promotora como se ha definido en la reivindicación 1 o 4.

15. Una construcción que comprende una secuencia potenciadora y promotora unida operativamente a un sitio de restricción, en la que:

(i) la secuencia potenciadora y promotora es como se ha definido en la reivindicación 1 o 3; y

(ii) la inserción de las secuencias de codificación en el sitio de restricción generará su unión operativa con la secuencia potenciadora y promotora.