Composiciones de vacuna que comprenden un adyuvante de saponina.

Una composición inmunógena que comprende un antígeno de C. trachomatis en combinación con un adyuvanteque comprende una fracción de saponina inmunológicamente activa derivada de la corteza de Quillaja SaponariaMolina presentada en forma de un liposoma y un lipopolisacárido,

en la que dicha fracción de saponina y dicholipopolisacárido están ambos presentes en la composición a un nivel de entre 1 μg y 30 μg por dosis, para su usocomo un medicamento humano.

Composiciones de vacuna que comprenden un adyuvante de saponina

Campo técnico

La presente invención se refiere a composiciones de vacunas mejoradas, a procedimientos para fabricarlas y a suuso en medicina. En particular, la invención se refiere a composiciones de vacunas potenciadas potenciadas con adyuvante en las que el adyuvante es una formulación liposomal, que comprende una saponina y un lipopolisacárido.

Antecedentes técnicos Se necesitan siempre composiciones o vacunas nuevas con una inmunogenicidad mejorada. Como estrategia, se han usado adyuvantes para probar y mejorar la respuesta inmunitaria provocada por cualquier antígeno dado.

Los lipopolisacáridos (LPS) son las moléculas superficiales principales y se encuentran exclusivamente en la lámina externa de la membrana exterior de bacterias gram-negativas. Los LPS impiden la destrucción de la bacteria por complementos del suero y células fagocíticas y están implicados en la adherencia para la colonización. Los LPS son un grupo de moléculas complejas estructuralmente relacionadas de aproximadamente 10.000 Dalton de tamaño yconsisten en tres regiones unidas de forma covalente:

(i) una cadena de polisacárido O-específica (antígeno O) en la región externa

(ii) una región central de oligosacárido del núcleo

(iii) lípido A-la región más interna que sirve como unión hidrófoba, comprende unidades de disacárido de glucosamina que llevan ácidos grasos de cadena larga.

Se ha mostrado que las actividades biológicas de LPS, tales como toxicidad letal, pirogenicidad y capacidad de actuar como adyuvantes, están relacionadas con el resto de lípido A. Por el contrario, la inmunogenicidad está asociada con el componente de polisacárido O-específico (antígeno O) . Tanto los LPS como el lípido A se conocen desde hace tiempo por sus efectos adyuvantes fuertes, pero la alta toxicidad de estas moléculas ha impedido su uso en formulaciones de vacunas. Se ha hecho por lo tanto un esfuerzo significativo para reducir la toxicidad de los LPS

o lípido A manteniendo al mismo tiempo su capacidad de actuar como adyuvantes.

El mutante R595 de Salmonella minnesota se aisló en 1996 a partir de un cultivo de la cepa parental (lisa) (Luderitzy col. 1966 Ann. N. Y. Acad. Sci. 133:349-374) . En las colonias seleccionadas se exploró su susceptibilidad a lisis con un grupo de fagos y solo las colonias que presentaron un intervalo de sensibilidad estrecho (susceptibles a uno

o dos fagos solamente) se seleccionaron para estudio adicional. Este esfuerzo condujo al aislamiento de una cepa mutante rugosa profunda que es defectuosa en la biosíntesis de LPS y se denomina S. minnesota R595.

En comparación con otros LPS, los producidos por el mutante S. minnesota R595 tienen una estructura relativamente sencilla.

(i) no contienen región O-específica-una característica que es responsable de la deriva del fenotipo liso de tipo salvaje al fenotipo rugoso mutante y produce una pérdida de virulencia

(ii) la región del núcleo es muy corta-esta característica aumenta la susceptibilidad de la cepa a una diversidad de productos químicos

(iii) el resto de lípido A está altamente acilado con hasta 7 ácidos grasos.

El 4’-monofosforil lípido A (MPL) , que puede obtenerse por la hidrólisis ácida de LPS extraído de una cepa mutante rugosa profunda de bacterias gram-negativas, mantiene las propiedades adyuvantes de los LPS demostrando una toxicidad que está reducida en un factor de más de 1000 (como se mide por dosis letal en huevos embrionarios de pollo) (Johnson y col. 1987 Rev. Infect. Dis. 9 Supl.: S512-S516) . Los LPS se calientan a reflujo típicamente en soluciones de ácido mineral para moderar su fuerza (por ejemplo, HCl 0, 1 M) durante un periodo deaproximadamente 30 minutos. Este procedimiento produce desfosforilación en la posición 1 y descarbohidrataciónen la posición 6’, produciendo MPL.

El monofosforil lípido A 3-O-desacilado (3D-MPL) , que puede obtenerse por hidrólisis alcalina leve de MPL, tiene una toxicidad reducida adicionalmente manteniendo de nuevo la capacidad de actuar como adyuvantes, véase eldocumento US 4.912.094 (Ribi Immunochemicals) . La hidrólisis alcalina se realiza típicamente en disolvente orgánico, tal como una mezcla de cloroformo/metanol, por saturación con una solución acuosa de una base débil, talcomo carbonato sódico 0, 5 M a pH 10, 5.

Se dispone de información adicional sobre la preparación de 3D-MPL en, por ejemplo, los documentos US 4.912.094 y WO02/078637 (Corixa Corporation) .

Las saponinas de Quillaja son una mezcla de glucósidos de triterpeno extraídos de la corteza del árbol Quillajasaponaria. Se han empleado de forma extensa saponinas brutas como adyuvantes veterinarios. Quil-A es un extracto acuoso parcialmente purificado del material de saponina de Quillaja. QS21 es una fracción no tóxica purificada por HPLC de Quil A y su procedimiento de producción se describe (como QA21) en la Patente de Estados Unidos N.º: 5.057.540.

A modo de ejemplo, se han desarrollado vacunas contra la gripe y vacunas contra el virus de papiloma humano (VPH) con adyuvantes.

El documento WO96/33739 divulga una composición de vacuna que comprende una saponina inmunológicamente activa y un esterol.

Todavía hay una necesidad de vacunas mejoradas.

Los adyuvantes que contienen lipopolisacáridos y saponinas de Quillaja se han descrito anteriormente, por ejemplo en el documento EP0671948. Esta patente demostró una fuerte sinergia cuando se combinaba un lipopolisacárido (3D-MPL) con una saponina de Quillaja (QS21) . Ahora se ha descubierto que pueden conseguirse buenas propiedades adyuvantes con combinaciones de lipopolisacárido y saponina de quillaja como inmunoestimulantes en una composición adyuvante incluso cuando los inmunoestimulantes están presentes en bajas cantidades en una dosis humana.

Estado de la invención La presente invención proporciona una composición inmunógena que comprende un antígeno de C. trachomatis en combinación con un adyuvante que comprende una fracción de saponina inmunológicamente activa derivada de lacorteza de Quillaja Saponaria Molina presentada en forma de un liposoma y un lipopolisacárido, en la que dicha fracción de saponina y dicho lipopolisacárido están ambos presentes en dicha dosis humana a un nivel de entre 1 μgy 30 μg, para su uso como un medicamento humano.

Adecuadamente, el adyuvante de saponina en forma de un liposoma de acuerdo con la invención comprende una fracción activa de la saponina obtenida de la corteza de Quillaja Saponaria Molina, tal como QS21 y un esterol, tal como colesterol, en una proporción saponina:esterol de 1:1 a 1:100 p/p.

En particular, dicha composición inmunógena comprende un antígeno con un epítopo de célula T CD4. Como alternativa, dicha composición inmunógena comprende un antígeno con un epítopo de célula B.

Se revela en el presente documento el uso de (a) un antígeno o preparación antigénica del mismo y (b) unadyuvante como se ha definido anteriormente en el presente documento en la preparación de una composición inmunógena para inducir, en un ser humano, al menos una, o al menos dos, o todas de las siguientes: (i) una respuesta inmunitaria de células T CD4 mejorada contra dicho antígeno o preparación antigénica del mismo, (ii) una respuesta inmunitaria humoral mejorada contra dicho antígeno o preparación antigénica del mismo, (iii) una respuesta de células B de memoria mejorada contra dicho antígeno o preparación antigénica del mismo.

También se revela en el presente documento el uso de un antígeno o preparación antigénica del mismo y unadyuvante según se define en el presente documento en la preparación de una composición inmunógena para lavacunación de un ser humano, en particular un ser humano adulto anciano, contra el patógeno del que se obtiene elantígeno en la composición inmunógena.

Como se revela en la presente memoria, la composición inmunógena puede inducir una respuesta inmune decélulas T CD4 mejorada frente a dicho antígeno o preparación antigénica del mismo, y en particular es capaz, adicionalmente, de inducir, bien una respuesta inmune humoral, o bien una respuesta de células B de memoria mejorada, o ambas, en comparación con la que se obtiene con el antígeno o composición antigénica sin adyuvante. Especificamente dicha respuesta inmune de c´lulas T CD4 implica la inducción de una respuesta auxiliar de T CD4de reactividad cruzada. Especificamente dicha respuesta inmune humoral implica la inducción de una respuesta inmune humoral de reactividad cruzada.

También se revela... [Seguir leyendo]

1. Una composición inmunógena que comprende un antígeno de C. trachomatis en combinación con un adyuvanteque comprende una fracción de saponina inmunológicamente activa derivada de la corteza de Quillaja Saponaria Molina presentada en forma de un liposoma y un lipopolisacárido, en la que dicha fracción de saponina y dicho lipopolisacárido están ambos presentes en la composición a un nivel de entre 1 μg y 30 μg por dosis, para su uso como un medicamento humano.

2. La composición inmunógena para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en la que dicha composición adyuvante comprende adicionalmente un esterol, en la que la relación de saponina:esterol es de 1:1 a 1:100 p/p.

3. La composición inmunógena para su uso de acuerdo con la reivindicación 2, en la que dicho esterol es colesterol.

4. La composición inmunógena para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que dicha fracción de saponina inmunológicamente activa es QS21.

5. La composición inmunógena para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que dicho lipopolisacárido es un derivado de lípido A.

6. La composición inmunógena para su uso de acuerdo con la reivindicación 5, en la que dicho derivado de lípido A e.

3. MPL.

7. La composición inmunógena para su uso de acuerdo con la reivindicación 6, en la que la relación QS21:3D-MPLes 1:1.

8. La composición inmunógena para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende un antígeno de C. trachomatis en combinación con un adyuvante que comprende QS21 presentada enforma de un liposoma .

3. MPL en la que dicha QS21 y dich.

3. MPL están ambos presentes en la composición a un nivel de entre 5 μg y 15 μg por dosis.

9. La composición inmunógena para su uso de acuerdo con la reivindicación 8, que comprende un antígeno de C. trachomatis en combinación con un adyuvante que comprende QS21 presentada en forma de un liposoma .

3. MPL en la que dicha QS21 y dich.

3. MPL están ambos presentes en la composición a un nivel de entre 7 μg y 13μg por dosis.

10. La composición inmunógena para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende un antígeno de C. trachomatis en combinación con un adyuvante que comprende QS21 presentada enforma de un liposoma .

3. MPL en la que dicha QS21 y dich.

3. MPL están ambos presentes en la composición a un nivel de entre 20 μg y 30 μg por dosis.

11. La composición inmunógena para su uso de acuerdo con la reivindicación 10, que comprende un antígeno de C. trachomatis en combinación con un adyuvante que comprende QS21 presentada en forma de un liposoma .

3. MPL en la que dicha QS21 y dich.

3. MPL están ambos presentes en la composición a un nivel de 25 μg por dosis.

12. La composición inmunógena para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en la que elantígeno de C. trachomatis es Ct858 o un fragmento inmunógeno del mismo.

13. La composición inmunógena para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en la que elantígeno de C. trachomatis es Ct089 o un fragmento inmunógeno del mismo.

14. La composición inmunógena para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en la que elantígeno de C. trachomatis es Ct875 o un fragmento inmunógeno del mismo.

15. La composición inmunógena para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en la que elantígeno de C. trachomatis es PmpDpd.

Figura 1–Preparación de MPL

MPL® en polvo ↓ Suspensión (10 mg/ml) ↓ Tratamiento térmico ↓ Enfriamiento ↓ Microfluidización ↓ Dilución a 2 mg/ml ↓ Prefiltración en 0, 65 μm ↓ Filtración en 0, 2 μm ↓ Dilución a 1 mg/ml ↓ Almacenamiento a +2/+8ºC

Figura 2–Inmunidad humoral contra diversas cepas de gripe tras inmunización de hurones con formulaciones experimentales (prueba de inhibición de hemaglutinación (GMT +/-IC95)

Figura 3–Estudio con hurones-Valoración vírica en lavados nasales después de exposición (día 42)

Simple trivalente MPL/QS21 trivalente Figura 4–Estudio con ratones-Respuesta humoral contra las tres cepas de vacuna de gripe tras inmunización de ratones con formulaciones experimentales: prueba de inhibición de hemaglutinación (GMT +/-IC95) 21 días después de la inmunización Figura 5–Estudio con ratones-Respuesta inmunitaria mediada por células: respuestas de células T CD4+ específicas de gripe en el día 7 tras la inmunización.

% gripe entera en células T CD4+ específicas % gripe entera en células T CD4+ específicas

triv

triv triv

triv

triv

triv triv triv

Figura 6-CMI para CD4-Cepa combinada (todo doble) -Día 0 y Día 21

Figura 7-GMT en días 0 y 21 para anticuerpos HI

GMT en el día 21 GMT en el día 0

Figura 8 Incidencia de síntomas locales y generales en seres humanos (total y relacionada con el grado 3) durante el periodo de seguimiento de 7 días % de síntomas reseñados (con IC 95%)

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10

Síntomas generales Síntomas locales

Flu YNG Rel. de grado 3Flu ELD

Rel. de grado 3 AS01B

Rel. de grado 3 AS01E

Rel. de grado 3

Flu YNGRel. de grado 3 Flu ELDRel. de grado 3 AS01BRel. de grado 3 AS01E Rel. de grado 3

Grupo de vacuna

Figura 9: respuestas humorales a VPH 16 y 18 L1.

Figura 10: tinción de citocina intracelular-VLP16 y células T CD4+ 18

Figura 11: producción de células B de memoria específicas después de la inmunización con formulaciones de VPH potenciadas con adyuvante.

Figura 12: comparación preclínica de vacunas de S. pneumoniae potenciadas con adyuvante en ratones.

Figura 13: titulaciones de ELISA Anti-gB en cobaya después de la inmunización con vacuna Gb adyuvante Figura 14: titulaciones neutralizantes Anti CMV en cobaya después de la inmunización con vacuna Gb adyuvante.

Figura 15: titulaciones de ELISA Anti-gB en ratones después de la inmunización con vacuna gB adyuvante.

Figura 16: titulaciones neutralizantes Anti CMV en ratones después de la inmunización con vacuna gB potenciada.

Figura 17: inmunidad mediada por células-Células CD4+ y CD8+ específicas para CMV después de la reestimulación con una reserva de péptidos gB (7 días después de la segunda inmunización) .

Restimulación con péptidos de gB 2 μg/ml

Reestimulación % específico de CMV en la población de CD4+

2, 0

1, 5

1, 0

0, 5

0, 0

1, 5μg gB simple 0, 00CD4+IL2+INFg+ CD4+IL2+

CD4+INFg+

1, 5μg gB

1, 5μg gB

Nacl

AS01b

AS01e 0, 02

0, 00

0, 00

0, 00

0, 02

0, 02

0, 00

0, 00

0, 07

0, 02

0, 02

Figura 18: inmunidad mediada por células-Células CD4+ específicas para CMV después de la re-estimulación con dos dosificaciones diferentes de una reserva de péptidos gB (21 días después de la segundainmunización) .

Figura 19: inmunidad mediada por células-Células CD8+ específicas para CMV después de la re-estimulación con dos dosificaciones diferentes de una reserva de péptidos gB (21 días después de la segundainmunización) .

Figura 20: titulaciones de anticuerpo en media geométrica (GMT) contra proteína de Circumsporozoito CSP después de la inmunización con vacuna RTS, S potenciada con adyuvante en ratones.

Nota: los resultados se presentan como la media geométrica de titulaciones de Ab anti-CSP de grupos de ratones de dos experimentos y sus límites de confianza del 95 %.

Figura 21: titulaciones de anticuerpo en media geométrica (GMT) contra antígeno de superficie de Hepatitis B (HB) después de la inmunización con vacuna RTS, S potenciada con adyuvante en ratones.

AS01B AS01E

RTS, S 10μg -AS01B RTS, S 5μg -AS01BRTS, S 2, 5μg -AS01B RTS, S 10μg -AS01E RTS, S 5μg -AS01ERTS, S 2, 5μg -AS01E

Figura 22: expresión ex vivo de IL-2 y/o IFN gamma por células T CD4 y CD8 específicas para CSP

Figura 23: expresión ex vivo de IL-2 y/o IFN gamma por células T CD4 y CD8 específicas para HB.

Figura 24: respuestas humorales en ratones después de la inmunización con vacuna contra la gripe dividida trivalente potenciada con adyuvante (inmunoestimulantes a dos concentraciones diferentes) .

Figura 25: respuesta inmunitaria mediada por células en ratones después de inmunización con vacuna contra la gripe potenciada con adyuvante (inmunoestimulantes a dos concentraciones diferentes) .

Figura 26: resultados preclínicos en ratones de comparación del adyuvante para vacunas VZV gE con AS01 B o AS01 E.

Figura 27: titulaciones virales de lavados nasales tras sensibilización y exposición a antígenos del virus dela gripe (simple o potenciado con adyuvantes) en hurones.

Figura 28: monitorización de la temperatura corporal en hurones tras sensibilización y exposición aantígenos de la gripe.

Titulaciones H1 (GMT +/-IC95)

Titulaciones HI (GMT +/-IC95)

Sensibilización simple triv. div. AS01B triv. div. AS01E triv. div.

exposición simple triv. div. AS01B triv. div. AS01E triv. div.

Figura 29: titulaciones anti HI para las cepas A en la formulación de vacuna trivalente tras inmunización y exposición a preparaciones del antígeno de la gripe.

Figura 30: titulaciones anti HI para las cepas B/Jiangsu y de deriva usadas para la exposición tras inmunización y exposición a preparaciones del antígeno de la gripe.