Composición para cicatrización de heridas.

Un método para producir una composición para cicatrización de heridas que comprende células de fibroblastos vivos en una matriz de soporte de fibrina sólida o semisólida,

en el que las células no están senescentes y tienen un fenotipo de cicatrización de heridas y en el que la composición es monocapa, comprendiendo el método las etapas de:

(i) formar la matriz de soporte que contiene las células vivas en la que las células están en suspensión en la matriz; donde la matriz de fibrina tiene una concentración de fibrina en el intervalo de 3 a 12 mg·mL-1; y

donde la matriz de soporte está formada con una densidad celular de 450 a 2.500 células por mm2;

(ii) incubar las células en la matriz de soporte durante 16 a 24 horas a 37ºC para permitir el desarrollo del fenotipo de cicatrización de heridas;

(iii) envasar la composición en un contenedor adecuado para almacenar la composición; y

(iv) almacenar la composición después de incubación y antes de su uso durante 40 días, a una temperatura de 2ºC a 8ºC, manteniendo a la vez el fenotipo de cicatrización de heridas.

Composición para cicatrización de heridas

La presente invención se refiere a composiciones y métodos para la regeneración de tejidos, particularmente para tratar lesiones cutáneas, tales como heridas. Las composiciones y métodos son útiles especialmente para ayudar en el proceso de cicatrización, particularmente en lesiones abiertas crónicas que son de cicatrización lenta o resistentes a la cicatrización.

La cicatrización de heridas abiertas que se extienden a través del epitelio germinal en un tejido por lo demás sano tiene lugar mediante el procedimiento descrito clásicamente como "segunda intención" que, después de la hemostasis inicial, implica una secuencia bien ordenada de inflamación, infiltración celular, angiogénesis, granulación y re-epitelialización. Como parte de la respuesta de cicatrización normal, es necesario que los fibroblastos residentes experimenten una serie de cambios fenotípicos, migrando al lugar de la herida, proliferando a continuación y después sintetizando y segregando moléculas de la matriz extracelular. In vivo, al menos una parte de los fibroblastos cambian entonces a un fenotipo miofibroblástico con el fin de facilitar la contracción de la herida.

In vitro, se han descrito varias poblaciones de fibroblastos mitóticos y post-mitóticos distinguibles fenotípicamente (Bayreuther et al., 1988, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85: 5112-5116). La vía de diferenciación parece estar controlada, al menos en parte, por interacciones entre los fibroblastos y las proteínas de la matriz extracelular (abreviado generalmente como ECM por sus iniciales en inglés: extracellular matrix) presentes en el lugar de la herida. Los factores de crecimiento y las citocinas también ejercen sin ninguna duda una influencia importante, aunque sus efectos también parecen estar modulados por la exposición de los fibroblastos a proteínas de la ECM particulares. Entre las proteínas de la ECM que parecen tener un papel importante en la diferenciación de los fibroblastos están el fibrinógeno y la fibrina. Los fibroblastos interactúan específicamente con los restos "RGD" de la fibrina y el fibrinógeno a través de receptores de integrina avp3 aunque la respuesta celular es compleja y está modulada por otros factores. Estudios in vitro del efecto del pegamento de fibrina sobre los fibroblastos del ligamento periodontal humano han sugerido que la fibrina parece inhibir ligeramente la proliferación de los fibroblastos. También se ha informado de que la presencia de una matriz de fibrina aumenta la síntesis de colágeno por los fibroblastos inmovilizados (Neidert et al., 21, Proceedings ofthe ASME Bioengineering Conference, Kamm et al. [Eds] Vol. 5: 215-126).

También se sabe que los fibroblastos tienen un papel en la remodelación de los coágulos de fibrina. A medida que se emplazan las nuevas proteínas de la matriz extracelular, tales como colágeno de tipo I y III, fibronectina y vitronectina, la matriz de fibrina se descompone, predominantemente por la activación de la plasmina, enzima derivada del plasma. Esto está regulado por la activación (o inhibición) de su proenzima, el plasminógeno, mediante varios activadores e inhibidores del plasminógeno. In vivo, varias células infiltrantes, tales como neutrófilos y macrófagos, segregan el activador de plasminógeno de tipo urocinasa (uPA), mientras que las células endoteliales son responsables principalmente de la producción del activador del plasminógeno tisular (tPA). Los fibroblastos también segregan tanto uPA como inhibidores del activador del plasminógeno, tales como el inhibidor del activador del plasminógeno de tipo 1 (PA-1). El equilibrio entre estos mediadores antagónicos es crucial para controlar la remodelación de la fibrina y la formación de la cicatriz. La expresión de los mediadores antagónicos está regulada en su desarrollo e Igualmente está controlada por los componentes de la matriz extracelular y factores de crecimiento locales.

Para facilitar el movimiento a través de un coágulo de fibrina reticulada y de una red ajustada de la matriz extracelular, varias enzimas derivadas de los fibroblastos y del suero dividen una vía de migración. Estas incluyen la colagenasa intersticial (metaloproteinasa-1 de la matriz, MMP-1), gelatinasa (metaloproteinasa-2 de la matriz, MMP- 2), estromelisina (metaloproteinasa-3 de la matriz, MMP-3) y los activadores del plasminógeno. Los factores quimiotácticos, tales como TGF-p y PDGF, pueden sobrerregular la producción y secreción de estas enzimas.

Una vez que los fibroblastos migratorios alcanzan una herida, se vuelven gradualmente secretores y aumenta la síntesis de proteínas. El retículo endoplasmático previamente replegado y el aparato de Golgi se dispersan a través del citoplasma y se produce una pérdida de matriz que está compuesta principalmente de fibronectina y colágeno del tipo III. Finalmente, este fenotipo profibrótico asume el control, lo que se caracteriza por la abundancia de retículo endoplasmático rugoso y aparato de Golgi, segregando colágeno recientemente sintetizado como respuesta al TGF- (5 altamente expresado. No obstante, el TGF-p no logra sobrerregular la deposición más extensa del colágeno una vez que la matriz ha sido depositada. También se cree que la IL-4 segregada por los mastocitos induce un pequeño aumento en el colágeno de tipos I y III junto con la fibronectina. Los mastocitos además producen abundantemente triptasa (una serina esterasa), la cual se ha demostrado que sobrerregula la proliferación de fibroblastos.

Estímulos tales como TGF-a, TGF-p y PDGF responsables de la proliferación de fibroblastos y síntesis de la matriz han sido ampliamente investigados in vitro (Derynck, 1988, Ce// 54: 593-595; Ross & Raines, 199, en: Growth Factors: From genes to clinical applications, Sara et al. [Eds], págs.. 193-199, Raven Press, Nueva York; Sporn & Roberts, 1992, J. Cell Biol. 119: 117-121) y por manipulación in vivo de heridas (Sprugel et al., 1987, Am. J. Pathol. 129: 61-613; Pierce et al., 1991, J. Cell Biochem. 45: 319-326). Por otra parte, se ha demostrado que el

¡nterferón y tiene un efecto negativo sobre el potencial sintético y mitogénico de los fibroblastos in vitro e in vivo (Duncan & Berman, 1985, J. Exp. Med. 162: 516-527; Granstein et al., 1987, J. Clin. Invest. 79: 1254-1258). Además, la misma matriz de colágeno puede suprimir estas actividades (Grinnel, 1994, J. Cell. Biol. 124: 41-44; Clark et al., 1995, J. Cell Sci. 18: 1251-1261) mientras que la matriz de fibrina o de fibronectina no tiene efecto supresor o este es pequeño (Clark et al., 1995 supra). Muchos fibroblastos experimentan apoptosis (muerte celular programada) en heridas cicatrizando durante 1 días marcando de esta forma la transición de un tejido de granulación rico en fibroblastos a un tejido cicatricial con una densidad celular reducida.

Cuando una herida ha destruido la capa germinal del epitelio, la deposición de colágeno por los fibroblastos infiltrantes y la re-epitelialización produce un grado de formación de cicatriz, con restauración incompleta de la función en lo que se refiere a la flexibilidad y la elasticidad de la dermis original y fallo en la regeneración de estructuras auxiliares tales como folículos capilares y glándulas sudoríparas.

Varios factores pueden afectar adversamente la tasa y la extensión de dicha cicatrización de las heridas, en particular, un suministro sanguíneo pobre. Un tejido pobremente perfundido, asociado a menudo con un retorno venoso deficiente y venas varicosas, enfermedad vascular periférica o diabetes, a menudo no logra cicatrizar satisfactoriamente lo que da lugar a úlceras crónicas, aunque los detalles de la patogénesis todavía no están claros. Las úlceras crónicas en las piernas son particularmente un problema significativo y creciente a nivel mundial.

Se han intentado varios enfoques para el tratamiento de las heridas. Se ha usado el injerto autógeno de piel para cerrar heridas abiertas, minimizar el riesgo de infección oportunista, acelerar la cicatrización y minimizar la formación de cicatrices. El trasplante de piel tiene limitaciones importantes, en particular el requisito de un lugar adecuado para la donación a partir del que se pueda tomar el injerto, lo que es un problema particular en los casos en los que las heridas son extensas (por ejemplo, con quemaduras). Además, los injertos tienen una tasa de éxito pequeña cuando la cicatrización de las heridas está en riesgo.

Con respecto a las úlceras crónicas en las piernas en particular, la introducción de terapia de compresión en combinación con apósitos húmedos ha sido el tratamiento terapéutico convencional.

Más recientemente han llegado a estar disponibles soluciones de... [Seguir leyendo]

1.- Un método para producir una composición para cicatrización de heridas que comprende células de fibroblastos vivos en una matriz de soporte de fibrina sólida o semisólida, en el que las células no están senescentes y tienen un fenotipo de cicatrización de heridas y en el que la composición es monocapa, comprendiendo el método las etapas de:

(i) formar la matriz de soporte que contiene las células vivas en la que las células están en suspensión en la matriz; donde la matriz de fibrina tiene una concentración de fibrina en el intervalo de 3 a 12 mg-mL'1; y donde la matriz de soporte está formada con una densidad celular de 45 a 2.5 células por mm2;

(ii) incubar las células en la matriz de soporte durante 16 a 24 horas a 37°C para permitir el desarrollo del fenotipo de cicatrización de heridas;

(¡ii) envasar la composición en un contenedor adecuado para almacenar la composición; y

(iv) almacenar la composición después de incubación y antes de su uso durante 4 días, a una temperatura de 2°C a 8°C, manteniendo a la vez el fenotipo de cicatrización de heridas.

2.- El método según la reivindicación 1, en el que la composición se almacena después de la incubación y antes de su uso durante hasta 19 días.

3.- El método según la reivindicación 1, en el que la composición se almacena después de la incubación y antes de su uso durante 7 a 14 días.

4.- El método según la reivindicación 1, en el que la composición se almacena después de la incubación y antes de su uso durante 7 a 11 días.

5.- El método según la reivindicación 1, en el que la composición se almacena después de la incubación y antes de su uso a una temperatura de 3°C a 5°C.

6.- El método según la reivindicación 1, en el que la composición se almacena después de la incubación y antes de su uso a una temperatura de 4°C.

7.- El método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que las células son de mamífero.

8.- El método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que las células son humanas.

9.- El método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la composición contiene células que son sólo fibroblastos.

1.- El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la composición contiene células que son 9% a 1% fibroblastos.

11.- El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 ó 1, en el que la composición contiene células que son 95% a 99,5% fibroblastos.

12.- El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, 1 u 11, en el que la composición contiene células que son 97,5% a 99% fibroblastos.

13.- El método según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, en el que los fibroblastos son fibroblastos dérmicos.

14.- El método según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, en el que los fibroblastos son fibroblastos dérmicos humanos.

15.- El método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la composición contiene células que excluyen los queratinocitos.

16 - El método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que las células son sintéticamente

activas.

17.- El método según la reivindicación 16, en el que las células sintetizan proteínas de la matriz extracelular, tales como colágeno de tipos I y III, fibronectlna y vltronectlna.

18.- El método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que las células son no proliferativas.

19.- El método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que las células están en suspensión uniformemente en la matriz.

2.- El método según la reivindicación 1, en el que la fibrina tiene una concentración en el intervalo de 7 a 12

mg-mL'1.

21- El método según la reivindicación 1, en el que la fibrina tiene una concentración en el intervalo de 3 a 5 mg-mL"1.

22 - El método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la matriz de fibrina está formada por la polimerización del fibrinógeno mediada por la trombina.

23.- El método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la matriz es no pirogénica y/o estéril.

24.- El método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende además una etapa de añadir un inhibidor de la proteasa.

25.- El método según la reivindicación 24, en el que el inhibidor de la proteasa es aprotinina y/o ácido tranexámico.

26.- El método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la composición formada en la etapa (i) tiene un grosor de 8 mm o menos.

27.- El método según la reivindicación 26, en el que la composición formada en la etapa (i) tiene un grosor de 5 mm o menos.

28.- El método según la reivindicación 75 a 2. células por mm2

29.- El método según la reivindicación 9 a 1.7 células por mm2

3.- El método según la reivindicación 1.5 células por mm2.

31.- El método según la reivindicación 45 a 55 células por mm2.

32.- El método según la reivindicación 5 células por mm2

33.- El método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la composición se envasa en un contenedor adecuado para transportar la composición y/o para aplicar la composición por vía tópica a una superficie de piel.

34.- El método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la composición se envasa en un contenedor que comprende una bolsa flexible que consiste en dos hojas de material flexible impermeable sellado periféricamente para proporcionar un medio de contención para la composición, comprendiendo la bolsa una primera superficie interna a la que la composición se adhiere con un nivel de adhesión mayor que el nivel entre la composición y una segunda superficie interna de la bolsa, pero menor que el nivel entre la composición y la superficie de la piel, de forma que al usarse la bolsa puede abrirse separando las hojas y la composición puede manipularse convenientemente y aplicarse directamente a la superficie de la piel sin ningún requisito adicional para que la composición sea tocada directamente por ningún otro medio antes de su aplicación.

35.- El método según la reivindicación 34, en el que el contenedor es un "material para bolsa pelable resistente a los disolventes" de Oliver [MR] Products Company (Número de producto: Q15/48BF1).

36.- El método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la etapa de formar la matriz de soporte se produce en un molde.

37.- Una composición para cicatrización de heridas que comprende células de fibroblastos dérmicos humanos vivos en suspensión en una matriz de soporte de fibrina, sólida o semisólida, no pirogénica, monocapa, estéril, formada por polimerización del fibrinógeno mediada por la trombina, en la que la matriz de fibrina tiene una concentración de fibrina en el intervalo de 3 a 12 mg-mL-1, donde la matriz de soporte está formada con una densidad celular de 45 a 2.5 células por mm2, y donde la composición ha sido incubada durante 16 a 24 horas a 37°C de forma que las células no son senescentes y tienen un fenotipo de cicatrización de heridas, en el que la composición se envasa después de la incubación en un contenedor adecuado para almacenar la composición.

38.- La composición para cicatrización de heridas según la reivindicación 37, en la que la composición se envasa en un contenedor adecuado para transportar la composición y/o aplicar la composición por vía tópica a una superficie de piel.

39.- La composición para cicatrización de heridas según la reivindicación 38, en la que el contenedor comprende una bolsa flexible que consiste en dos hojas de material flexible impermeable sellado periféricamente para

1, en el que la matriz de soporte está formada con una densidad celular de

1, en el que la matriz de soporte está formada con una densidad celular de

1, en el que la matriz de soporte está formada con una densidad celular de

1, en el que la matriz de soporte está formada con una densidad celular de

1, en el que la matriz de soporte está formada con una densidad celular de

proporcionar un medio de contención para la composición, comprendiendo la bolsa una primera superficie interna a la que la composición se adhiere con un nivel de adhesión mayor que el nivel entre la composición y una segunda superficie interna de la bolsa, pero menor que el nivel entre la composición y la superficie de la piel, de forma que al usarse la bolsa puede abrirse separando las hojas y la composición puede manipularse convenientemente y 5 aplicarse directamente a la superficie de la piel sin ningún requisito adicional para que la composición sea tocada directamente por ningún otro medio antes de su aplicación.

4.- La composición para cicatrización de heridas según cualquiera de la reivindicación 38 o la reivindicación 39, en la que el contenedor es un "material para bolsa pelable resistente a los disolventes" de Ollver [MR] Products Company (Número de producto: Q15/48BF1).

41.- La composición para cicatrización de heridas según cualquiera de las reivindicaciones 37 a 4, para usarla

como un medicamento.

42.- La composición para cicatrización de heridas según cualquiera de las reivindicaciones 37 a 4, para usarla como un medicamento en el tratamiento de una lesión cutánea.

43.- La composición para cicatrización de heridas según cualquiera de las reivindicaciones 37 a 4 para usarla 15 según la reivindicación 42, para aplicación tópica a una lesión cutánea como una úlcera venosa, una úlcera

diabética, una escara por presión, una quemadura o una herida por Irritación ¡atrogénica.