Co-diferenciación de monocitos procedentes de donantes alogénicos.

Un método de producción de células dendríticas (CD) inmaduras,

no agotadas, que comprende las etapas de:

- proporcionar una mezcla de leucocitos alogénicos, los cuales han sido obtenidos de al menos dos donantes alogénicos diferentes;

- a partir de dicha mezcla de leucocitos alogénicos, aislar monocitos alogénicos, para ofrecer leucocitos alogénicos enriquecidos con monocitos; y

- generar CD inmaduras, no agotadas, procedentes de dichos leucocitos alogénicos enriquecidos con monocitos, en donde la generación de células dendríticas (CD) inmaduras, no agotadas, se lleva a cabo por co-cultivo de dichos leucocitos alogénicos enriquecidos con monocitos durante 2 a 7 días en un medio de cultivo celular acuoso, libre de suero no humano, en donde dicho medio se suplementa con interleuquina-4 (IL-4) y factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF).

Co-diferenciación de monocitos procedentes de donantes alogénicos Campo de la invención

La presente invención se refiere a un método para producir células dendríticas (CD) humanas inmaduras y no agotadas derivadas de monocitos.

Antecedentes

Con frecuencia, las terapias tradicionales contra el cáncer tales como cirugía, radiación y quimioterapia, son insuficientes para tratar al paciente y, a menudo, provocan importantes efectos adversos. La ¡nmunoterapia ha demostrado ser prometedora como método alternativo de tratamiento, con menos efectos secundarios negativos.

En la actualidad, está bien establecido que el sistema inmune posee células, en particular los linfocitos T cltotóxicos CD8+ (CTLs), capaces de reconocer y, potencialmente, destruir las células tumorales. Sin embargo, un problema importante es la ausencia de inducción, o una inducción escasa de la capacidad de destrucción de estas células T en el paciente oncológico. Una posibilidad es que haya una presentación y co-estimulaclón Inadecuadas del antígeno tumoral por parte de las células dendríticas (CD), los "adyuvantes de la naturaleza", para desencadenar una inmunidad funcional y específica contra el tumor de las células T en el paciente con cáncer.

Las estrategias inmunoterapéuticas existentes contra el cáncer se centran principalmente en CD autólogas, derivadas del paciente, cargadas de antígeno, que han sido diferenciadas y cargadas con antígeno ex vivo. La idea sobre la que se basa este abordaje es que la eficiencia y control que ofrece la manipulación ex vivo de las CD genera CD con una fuerte capacidad de presentación de antígeno y de co-estimulación. La calidad de la respuesta de las células T depende de la capacidad de estas CD autólogas para presentar los antígenos tumorales a las células T de forma restringida por el MHC (complejo principal de hlstocompatibilidad) (CD y células T deben proceder del mismo individuo) en los ganglios linfáticos de drenaje y crear, de este modo, una respuesta específica para el tumor de la célula T.

Las CD autólogas, derivadas de monocitos, son las CD más frecuentemente utilizadas en estudios piloto, dado que es posible obtener miles de millones de monocitos a partir de los leucocitos de la sangre periférica por leucoféresis, un procedimiento laborioso y que requiere mucho tiempo, en el que se separan leucocitos de la sangre circulante. Existen numerosos métodos para enriquecer monocitos subsiguientemente, dos de cuales, la elutrlaclón y el aislamiento de anticuerpos/perlas, también se pueden llevar a cabo en conformidad con las directrices de las Buenas Prácticas de Fabricación (GMP).

Posteriormente, los monocitos se cultivan en medios suplementados con GM-CSF e IL-4 durante 4 a 7 días, lo que da lugar a su diferenciación en CD inmaduras que se distinguen por su extraordinaria capacidad para producir grandes cantidades de quimiocinas y citoquinas pro-inflamatorias tras la subsiguiente estimulación con determinados tipos de factores de activación (Sallusto et al., Eur J Immunol, 1999, 29:1617; Napolitani et al., Nature Immunology, 2005, 6:769). Las CD estimuladas se someten habitualmente a una pre-pulsación con antígeno(s) tumoral(es) relevante(s) y se activan durante 1 a 2 días antes de la vacunación. No obstante, las respuestas inmunitarias a estas vacunas basadas en CD a menudo son débiles y las respuestas clínicas rara vez son completas y de larga duración.

Es poco lo que se conoce acerca del destino y función de las CD autólogas generadas ex vivo después de haberlas inyectado. En el ámbito humano, se ha monitorizado recientemente in vivo el patrón de migración de las CD de vacuna inyectadas y es de destacar que menos de 5% de las CD inyectadas alcanzó los ganglios linfáticos de drenaje, en tanto que la mayoría de las CD permaneció en el punto de inyección. Estas CD de vacuna atrapadas localmente perdieron rápidamente su viabilidad y fueron eliminadas más tarde por células reclutadas que presentan antígenos.

Ahora, se han ofrecido datos de que las CD de vacuna inyectadas que han sido activadas ex vivo durante un periodo de tiempo limitado (es decir, 6 a 18 h) se convierten en CD pro-inflamatorias, que son capaces de cebar de manera indirecta células T CD8+ nativas in vivo, actuando como un adyuvante inmunitario local puro. Esta función adyuvante de las CD Pl (pro-inflamatorias) inyectadas depende estrictamente de su secreción subsecuente de ciertas quimiocinas que reclutan CD y células NK en el momento de la administración (tras la retirada de los factores de activación). Estas CD Pl expresan/secretan también factores que inducen la activación de células NK endógenas y CD reclutadas en el punto de vacunación. En contraste con las CD Pl, las CD activadas por tiempo prolongado (es decir, >24 h), que se han usado a menudo en ensayos clínicos, se distinguen por su estado "agotado" (Langenkamp et al., 2000) y, por lo tanto, su incapacidad para secretar quimiocinas y factores de activación de CD deseables en el momento de la administración.

Como conclusión, las CD Pl no sólo pueden actuar como estimuladores directos de células T autólogas compatibles con el MHC, sino también como adyuvantes, produciendo grandes cantidades que quimiocinas y citoquinas proinflamatorias en el momento de la administración. La inyección local de CD Pl dará lugar al reclutamiento y activación de otras células inmunitarias, incluidas células NK circulantes y precursores de CD. Si las CD Pl que se

inyectan han sido cargadas previamente con antígenos tumorales relevantes, o se inyectan directamente en una lesión tumoral existente, las CD endógenas reclutadas absorberán las células de vacuna moribundas que expresan antígenos tumorales relevantes o células moribundas que expresan antigenos, respectivamente. Después de la activación, estas CD endógenas reclutadas y, subsiguientemente, cargadas con antigenos, migrarán hacia los ganglios linfáticos de drenaje en donde ceban células T especificas para el tumor de manera restringida para el MHC (Liu et al., 2008). Esta conclusión está avalada por datos de varios estudios preclinicos recientes en los que se redujo significativamente el crecimiento del tumor por medio de vacunaciones terapéuticas con CD Pl alogénicas, incompatibles con el MHC y no agotadas (Alder et al., 2008, Siders et al., 2009, Edlich et al., 2010).

Por lo tanto, la intensa función adyuvante de las CD Pl que, de manera importante, no requieren compatibilidad de MHC entre las CD Pl y las células T del paciente, introduce la posibilidad de utilizar CD Pl alogénicas, incompatibles con el MHC, producidas previamente y conservadas bajo congelación, como vacunas "prefabricadas", lo cual representa una alternativa práctica y viable a las vacunas de CD especificas para el paciente, hechas a medida. El uso de estas CD Pl alogénicas, incompatibles con el MHC, aparece descrito en los documentos EP 1.509.244 B1 y WO 2011/098516.

Por motivos éticos, no resulta factible la provisión a gran escala, por leucoféresis, de monocitos procedentes de donantes normales de sangre, con el único propósito de producir comercialmente vacunas a gran escala para uso clínico. Por lo tanto, en la práctica, la materia prima, es decir, los monocitos, para la producción de CD Pl está limitada a monocitos obtenidos de productos de desecho (capas leuco-plaquetarias y/o filtros de depleción leucocitaria usados) en el transcurso de la separación de leucocitos no deseados de diferentes componentes de la sangre entera, o monocitos obtenidos de capas leuco-plaquetarias en bancos de sangre.

Sin embargo, el número total de monocitos que se puede aislar de cada capa leuco-plaquetaria o de cada filtro de depleción leucocitaria de bolsas de sangre es, por lo general, menor a 200 millones (Ebner S. et al., "Generation of large numbers of human dendritic cells from whole blood passaged through leukocyte removal filters: an alternative to standard buffy coats", J Immunol Methods, 252 (2001)), lo que da lugar a costos inaceptablemente elevados para el enriquecimiento y posterior diferenciación de CD de lotes separados de monocitos (cada lote derivado de un único donante), con métodos que están en conformidad con las directrices de Buenas Prácticas de Fabricación (GMP) según la técnica.

Existe, por consiguiente, la necesidad en la técnica de un método para la producción a gran escala, económica y de calidad clínica, de células dendríticas inmaduras no agotadas a partir de productos de desecho que contienen monocitos, procedentes de bancos de sangre.

Resumen

En consecuencia, la presente invención intenta paliar, aliviar, eliminar o sortear una o más de las deficiencias e inconvenientes anteriormente mencionados... [Seguir leyendo]

1. Un método de producción de células dendríticas (CD) inmaduras, no agotadas, que comprende las etapas de:

proporcionar una mezcla de leucocitos alogénicos, los cuales han sido obtenidos de al menos dos donantes alogénicos diferentes;

a partir de dicha mezcla de leucocitos alogénicos, aislar monocitos alogénicos, para ofrecer leucocitos alogénicos enriquecidos con monocitos; y

generar CD inmaduras, no agotadas, procedentes de dichos leucocitos alogénicos enriquecidos con monocitos, en donde la generación de células dendríticas (CD) inmaduras, no agotadas, se lleva a cabo por co-cultivo de dichos leucocitos alogénicos enriquecidos con monocitos durante 2 a 7 días en un medio de cultivo celular acuoso, libre de suero no humano, en donde dicho medio se suplementa con ¡nterleuquina-4 (IL-4) y factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF).

2. El método según la reivindicación 1, en el que dicho medio de cultivo celular comprende al menos un polipéptido humano seleccionado del grupo que consiste en transferrina, albúmina e insulina.

3. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en el que dichos leucocitos alogénicos enriquecidos con monocitos comprenden neutrófilos alogénicos.

4. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicha mezcla de leucocitos alogénicos se provee combinando al menos dos capas leuco-plaquetarias que comprenden leucocitos, en donde dichas capas leuco-plaquetarias que se van a combinarse obtienen de al menos dos donantes alogénicos diferentes.

5. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicha mezcla de leucocitos alogénicos se provee:

eluyendo leucocitos de al menos dos filtros de depleción leucocltarla, los cuales han sido usados previamente para retirar leucocitos de la sangre entera, en donde dicha sangre entera se ha obtenido de al menos dos donantes alogénicos diferentes; y

combinando los leucocitos obtenidos para conseguir dicha mezcla de leucocitos alogénicos;

o:

eluyendo leucocitos de un filtro de depleción leucocltarla, el cual se ha utilizado para retirar leucocitos de capas leuco-plaquetarias combinadas, en donde las capas leuco-plaquetarias proceden de al menos dos donantes alogénicos diferentes.

6. El método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dichos monocitos alogénicos se aíslan por elutriación o por aislamiento de anticuerpos/perlas.

7. El método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho co-cultivo se lleva a cabo durante aproximadamente 5 días.

8. El método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores que comprende, adicionalmente, la etapa de cargar las CD inmaduras, no agotadas, con un antígeno.